HPLC 法同時(shí)測定外感風(fēng)痧顆粒中9 種成分

劉 雯 郭海姣 劉進(jìn)寶 羅宇東 王先軍 周麗園 覃潔萍*

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 廣西南寧530001； 2.廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院， 廣西南寧530200； 3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠， 廣西南寧530023）

外感風(fēng)痧顆粒為國家頒布標(biāo)準(zhǔn)品種、廣西傳統(tǒng)特色優(yōu)勢壯藥，組方源自壯族民間驗(yàn)方，由蒼耳草、狗仔花、藤苦參、山芝麻、崗梅、兩面針6 味藥材配方而成，功效祛風(fēng)清熱，主治風(fēng)熱感冒、咽喉腫痛，但其現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中只有性狀項(xiàng)和理化鑒別項(xiàng)，無法有效控制其質(zhì)量。目前，關(guān)于該制劑質(zhì)量控制的報(bào)道較少，僅涉及藤苦參、崗梅TLC 定性鑒別及綠原酸含有量測定［1］。

本實(shí)驗(yàn)通過查閱文獻(xiàn)［2?8］，對外感風(fēng)痧顆粒中各藥材所含成分進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)蒼耳草主要含有酚酸、蒽醌；藤苦參根中主要含有皂苷、糖類、甾醇等成分，其中強(qiáng)心苷是其主要藥效物質(zhì)；山芝麻根主要含有三萜；崗梅成分以三萜皂苷為主，也含有酚酸及少量甾體、單萜；兩面針根主要含有生物堿、苯丙素、黃酮、三萜、酰胺等化合物；狗仔花含有苯丙素、甾體、脂肪醇、脂肪酸等成分。通過對照品比對、紫外光譜解析、文獻(xiàn)［9?11］ 并結(jié)合課題組前期研究［12］，建立了HPLC 法同時(shí)測定外感風(fēng)痧顆粒中原兒茶酸、新綠原酸、隱綠原酸、原兒茶醛、綠原酸、咖啡酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C 的含有量，再通過聚類分析、主成分分析對其進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)研究。

1 材料

Waters e2695 型高效液相色譜儀，配置四元泵、柱溫箱、可變波長檢測器 （美國Waters 公司）；KQ5200B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SQP 電子分析天平［百萬分之一，賽多利斯科學(xué)儀器（北京） 有限公司］。外感風(fēng)痧顆粒共10 批（批號(hào)20180101、20180301、20180304、20180401、20180402、20180403、20190301、20190302、20190303、20190401），由廣西中醫(yī)藥大學(xué)百年樂制藥廠提供。原兒茶醛（批號(hào)110810?201608，純度99.3%）、咖啡酸 （批號(hào)110885?201703，純度99.7%）、原兒茶酸（批號(hào)110809?201205，純度99.9%）、綠原酸 （批號(hào)110753?201817，純度96.8%） 對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；異綠原酸B （批號(hào)3089）、隱綠原酸（批號(hào)3208）、新綠原酸（批號(hào)6630） 對照品均購自上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；異綠原酸C （批號(hào) RP180704），異綠原酸 A （批號(hào)RP180903） 對照品均購自成都麥德生科技有限公司。乙腈為色譜純；甲醇為分析純；水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 依利特Hypersil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈-0.2%磷酸，梯度洗脫（0～5 min，8% 乙腈；5～11 min，8%～12%乙腈；11～25 min，12%～21%乙腈；25～32 min，21%～31%乙腈；32～33 min，31%～100%乙腈；33～40 min，100% 乙腈）；體積流量1.0 mL／min；柱溫25 ℃；檢測波長273 nm （0～11.5、14～16 min）、327 nm （11.5～14 min、16～41 min）；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取原兒茶酸、新綠原酸、隱綠原酸、原兒茶醛、綠原酸、咖啡酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C 對照品適量，甲醇制成各成分質(zhì)量濃度分別為0.073 4、0.189 0、0.183 2、0.037 2、0.192 0、0.016 1、0.106 4、0.307 6、0.292 4 mg／mL 的溶液，即得。

2.3 供試品溶液制備 取顆粒10 袋，拆掉包裝，傾出內(nèi)容物，精密稱定質(zhì)量，計(jì)算平均裝量。將顆粒研細(xì)后取約10.0 g，精密稱定，置于錐形瓶中，精密加入25 mL 甲醇，稱定質(zhì)量，超聲40 min 后取出放冷至室溫，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 系統(tǒng)適用性、專屬性考察 精密吸取對照品、供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，結(jié)果見圖1。由此可知，相鄰組分分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)以最難分離的異綠原酸C 色譜峰計(jì)，應(yīng)不少于3 000。

2.5 線性關(guān)系考察 精密量取對照品溶液0.20、0.60、1.00、1.40、1.80 mL，置于10 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL 測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6 精密度試驗(yàn) 取“2.5” 項(xiàng)下對照品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，每次10 μL，測得原兒茶酸、新綠原酸、原兒茶醛、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 峰面積RSD 分別為0.93%、0.24%、0.14%、0.12%、0.14%、0.14%、0.13%、0.14%、0.14%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取6 份顆粒（批號(hào)20180301），按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件各進(jìn)樣10 μL 測定，測得原兒茶酸、新綠原酸、原兒茶醛、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 含有量RSD 分別為2.2%、1.1%、2.2%、1.7%、1.5%、3.0%、2.3%、3.1%、2.5%，表明該方法重復(fù)性良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液（批號(hào)20180301），于0、2、4、8、12、24 h 在 “2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL 測定，測得原兒茶酸、新綠原酸、原兒茶醛、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 峰面積RSD 分別為1.4%、1.7%、1.7%、2.5%、1.1%、2.6%、1.8%%、2.6%%、1.7%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取6 份顆粒 （批號(hào)20180301），每份約5.0 g，精密稱定，按照100%水平加入對照品溶液，按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL測定，計(jì)算回收率。結(jié)果，原兒茶酸、新綠原酸、原兒茶醛、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 平均加樣回收率分別為 95.6%、100.7%、97.1%、97.6%、98.4%、101.4%、103.5%、102.5%、103.4%，RSD 分別為2.1%、2.3%、2.8%、1.9%、2.4%、2.6%、2.6%、2.3%、2.5%。

2.10 樣品含有量測定 取10 批顆粒，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣10 μL 測定，計(jì)算每袋顆粒（標(biāo)示裝量15 g） 中各成分含有量，結(jié)果見表2。

2.11 化學(xué)計(jì)量學(xué)研究

2.1 1.1 聚類分析 通過SPSS 16.0 軟件將表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化運(yùn)算，以標(biāo)準(zhǔn)值為變量進(jìn)行聚類分析，分析方法選用組間聯(lián)接，度量標(biāo)準(zhǔn)選用“平方Euclidean 距離”，標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換值選擇“全距從0到1”，結(jié)果見圖2。由此可知，10 批樣品大體上被聚為3 類，其中第1 類包括20180301、20180401、20190301、20190302、20190303、20190401，第2 類包括20180304、20180402、20180403，第3 類包括20180101。

2.1 1.2 主成分分析 將表2 數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化得分作為變量，通過SPSS 16.0 軟件進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見表3～4。由表3 可知，前2 個(gè)主成分特征值均大于1，累積方差貢獻(xiàn)率達(dá)91.936%，基本可以反映各成分的全部信息。由表4 可知，主成分2 主要反映咖啡酸含有量信息，而主成分1 主要反映其他8 種成分含有量信息。

表2 各成分含有量測定結(jié)果（mg／袋）Tab.2 Results of content determination of various constituents （mg／bag）

圖2 10 批樣品聚類分析圖Fig.2 Cluster analysis diagram for ten batches of samples

表3 主成分特征值及貢獻(xiàn)率Tab.3 Eigenvalues and contribution rates for principal components

表4 主成分載荷矩陣Tab.4 Loading matrices for principal components

將每個(gè)原始變量轉(zhuǎn)換成標(biāo)準(zhǔn)化值后顯示在SPSS 16.0 軟件中，再將因子載荷矩陣中的系數(shù)除以2 個(gè)主成分各自對應(yīng)的特征根后開平方根，即為主成分中每個(gè)指標(biāo)所對應(yīng)的系數(shù)。根據(jù)系數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)化值結(jié)合軟件的計(jì)算變量功能，測定2 個(gè)主成分的得分值，并繪制得分圖，結(jié)果見圖3，可知10 批樣品被分為3 組，與聚類分析結(jié)果一致。

圖3 主成分分析得分圖Fig.3 Score plot for principal component analysis

3 討論

3.1 指標(biāo)成分選擇 本實(shí)驗(yàn)通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，外感風(fēng)痧顆粒中各藥材主要成分為酚酸、蒽醌、黃酮、三萜，前期曾嘗試檢測蒽醌、三萜、黃酮，但均未檢出。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇酚酸作為指標(biāo)成分。

3.2 提取條件選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了提取方法（回流、超聲、冷浸）、提取溶劑（甲醇、乙醇、70%甲醇、50%甲醇、純水）、提取時(shí)間（20、30、40、50 min），發(fā)現(xiàn)甲醇超聲40 min 時(shí)提取率最高，故以其為提取條件。

3.3 流動(dòng)相系統(tǒng)選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇?水、乙腈?水、乙腈?0.2%冰醋酸、甲醇?0.2%冰醋酸、甲醇?0.2% 磷酸、乙腈?0.2% 磷酸，發(fā)現(xiàn)以乙腈?0.2%磷酸洗脫時(shí)各成分分離度、峰型、對稱因子最佳，故以其為流動(dòng)相。

3.4 檢測波長選擇 原兒茶酸、原兒茶醛最大吸收波長為273 nm，而其他成分均為327 nm。因此，本實(shí)驗(yàn)采用波長轉(zhuǎn)換法，可使各成分均在其最大吸收波長下進(jìn)行測定，從而提高了分析靈敏度，減小了測定誤差。

3.5 化學(xué)計(jì)量學(xué)研究 聚類分析顯示，10 批樣品大體上被聚為3 類，第1 類20180301、20180401、20190301、20190302、20190303、20190401，第2 類20180304、20180402、20180403，第3 類20 180101；主成分分析顯示，前2 個(gè)主成分基本可反映各成分全部信息，能以其對樣品質(zhì)量進(jìn)行控制，其中主成分2 主要反映咖啡酸含有量信息，而主成分1 主要反映其他8 種成分含有量信息，與聚類分析結(jié)果一致。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立HPLC 法同時(shí)測定外感風(fēng)痧顆粒中原兒茶酸、新綠原酸、原兒茶醛、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 的含有量，該方法準(zhǔn)確、靈敏、可靠，重復(fù)性好，可用于該制劑的質(zhì)量控制。