桑葉多糖超聲?微波協(xié)同提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性

張 華 孟 博 王 莉 潘 婷 謝閏虎 朱文彬

（滁州學(xué)院材料與化學(xué)工程學(xué)院， 安徽滁州239000）

桑葉為桑科植物桑樹(shù)Morus albaL.的干燥葉，具有祛風(fēng)除濕、清肺潤(rùn)燥、平肝明目等功效［1?2］，現(xiàn)代研究表明，其主要活性成分為多糖、黃酮、生物堿、氨基酸、甾醇［3］。其中，多糖具有明顯的降血糖、降血脂作用［4］，在開(kāi)發(fā)藥品、保健品等方面前景廣闊。

關(guān)于桑葉多糖的提取，文獻(xiàn)報(bào)道方法主要有熱水浸提法、微波提取法、超聲波提取法、酶解法［5?8］等。其中，超聲波提取法利用超聲波對(duì)溶劑的空化作用和次級(jí)效應(yīng)，促進(jìn)植物多糖浸出，但其熱效應(yīng)不強(qiáng)，需要較長(zhǎng)時(shí)間才能達(dá)到足夠高的提取溫度；微波提取法利用微波能量加熱植物細(xì)胞內(nèi)部，使細(xì)胞內(nèi)的活性成分更易釋放［9?10］，將上述2種方法相結(jié)合時(shí)，具有提取率高、提取時(shí)間短、生物活性好的優(yōu)點(diǎn)。目前，已有將兩者聯(lián)合應(yīng)用于植物天然成分提取的報(bào)道［11?12］，但尚未涉及桑葉多糖。

因此，本實(shí)驗(yàn)采用超聲?微波協(xié)同提取桑葉多糖，響應(yīng)面法優(yōu)化工藝，并考察該成分抗氧化活性，以期為其深入開(kāi)發(fā)及相關(guān)產(chǎn)品研制提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑與藥物 桑葉采自滁州學(xué)院，經(jīng)滁州學(xué)院張偉鋼副教授鑒定為正品。1，1?二苯基?2?三硝基苯肼（DPPH）、葡萄糖（純度＞99.5%）、維生素C、無(wú)水乙醇、濃硫酸、苯酚均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器 SHZ?D （Ⅲ） 循環(huán)水式真空泵（鞏義市宇翔儀器有限公司）；TU1810 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）；微波超聲波組合萃取儀（上海比朗儀器制造有限公司）；BSM?120電子分析天平（上海卓精電子科技有限公司）。

2 方法

2.1 桑葉多糖提取 稱取一定量桑葉，烘干粉碎后過(guò)60 目篩，石油醚脫脂，80% 乙醇除去色素，干燥，密封置于干燥器中，取適量按一定液料比加入蒸餾水后混合均勻，超聲?微波協(xié)同浸提，抽濾，75%乙醇醇沉，離心，復(fù)溶，再進(jìn)行二次醇沉，干燥至恒定質(zhì)量，即得桑葉多糖。稱取1.0 g，加蒸餾水定容至100 mL 作為樣品溶液，備用。

2.2 桑葉多糖得率測(cè)定 采用苯酚?硫酸法［13?14］，在490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以其為縱坐標(biāo)（A），溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X） 進(jìn)行回歸，得方程為A＝2.151 5X＋0.001 17 （r＝0.998 2），在0.010～0.055 mg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。取1 mL 樣品溶液于試管中，加入蒸餾水1 mL、5%苯酚溶液1 mL、濃硫酸5 mL，水浴反應(yīng)15 min，在490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，代入上述回歸方程測(cè)定溶液質(zhì)量濃度，計(jì)算桑葉多糖得率，公式為得率＝n×c×V／m×100%，其中n為稀釋倍數(shù)；c為溶液質(zhì)量濃度，單位g／mL；V為提取物定容體積，單位mL；m為樣品質(zhì)量，單位g。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 吸取0.1 mg／mLD?無(wú)水葡萄糖對(duì)照品溶液0.5 mL，按“2.2” 項(xiàng)下方法平行測(cè)定6 次吸光度，測(cè)得其RSD 為1.86%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批桑葉多糖，按“2.1” 項(xiàng)下方法制備6 份樣品溶液，按“2.2” 項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，測(cè)得其RSD 為1.29%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.1” 項(xiàng)下方法制備樣品溶液，室溫下于0、2、4、8、10、12 h 按“2.2” 項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，測(cè)得其RSD 為1.39%，表明樣品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 加樣回收率試驗(yàn) 吸取9 份“2.1” 項(xiàng)下樣品溶液，按50%、100%、150%水平加入D?無(wú)水葡萄糖對(duì)照品溶液，平行3 份，按“2.2” 項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，測(cè)得其平均加樣回收率分別為95.82%、97.62%、96.57%，RSD 分別為1.63%、1.21%、1.89%。

2.4 DPPH 清除率測(cè)定 參考文獻(xiàn)［15］，稱取1.0 g桑葉多糖，無(wú)水乙醇制成不同質(zhì)量濃度溶液，各取1.0 mL，加0.1 mmol／L DPPH 乙醇溶液2.0 mL，室溫下避光反應(yīng)30 min，于517 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度Ai；以無(wú)水乙醇代替DPPH 乙醇溶液，測(cè)定吸光度Aj；以蒸餾水代替樣品溶液，測(cè)定吸光度A0，計(jì)算桑葉多糖對(duì)DPPH 自由基的清除率，公式為清除率＝ ｛ ［A0-（Ai-Aj）］ ／A0｝ ×100%。

3 結(jié)果

3.1 單因素試驗(yàn)

3.1.1 液料比 在超聲功率100 W、微波功率250 W、提取時(shí)間10 min 的條件下，考察液料比對(duì)多糖得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知，液料比10 ∶1～25 ∶1 （mL／g） 時(shí)多糖得率逐漸升高，在25 ∶1 （mL／g） 時(shí)達(dá)到最大，之后略有下降，其原因可能是液料比升高時(shí)溶劑增多，傳質(zhì)速率變大，可促進(jìn)多糖溶出，但溶劑過(guò)多容易造成超聲波、微波的大部分能量作用于溶劑上，作用于物料上的減少［16］。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1（mL／g） 進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

圖1 液料比對(duì)多糖得率的影響Fig.1 Effect of liquid?solid ratio on polysaccharides yield

3.1.2 超聲功率 在液料比20 ∶1、微波功率250 W、提取時(shí)間10 min 的條件下，考察超聲功率對(duì)多糖得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。由此可知，超聲功率50～150 W 時(shí)多糖得率逐漸升高，在150 W 時(shí)達(dá)到最大，但之后反而降低，其原因可能是超聲波振動(dòng)會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的空化和剪切效應(yīng)，使多糖傳質(zhì)效率提高，但振動(dòng)過(guò)大可破壞其糖苷鍵［17］。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇100、150、200 W 進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

圖2 超聲功率對(duì)多糖得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on polysaccharides yield

3.1.3 微波功率 在液料比20 ∶1、超聲功率100 W、提取時(shí)間10 min 的條件下，考察微波功率對(duì)多糖得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。由此可知，隨著微波功率升高，多糖得率先增后減，在250 W 時(shí)達(dá)到最大，其原因可能為微波功率升高可使溫度快速上升，多糖溶出速度變大，溶出量增多，但功率過(guò)大可阻礙介質(zhì)滲入［18］。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇150、200、250 W 進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

圖3 微波功率對(duì)多糖得率的影響Fig.3 Effect of microwave power on polysaccharides yield

3.1.4 協(xié)同時(shí)間 在液料比20 ∶1、超聲功率100 W、微波功率250 W 的條件下，考察協(xié)同時(shí)間對(duì)多糖得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。由此可知，多糖得率隨著協(xié)同時(shí)間延長(zhǎng)而升高，在15 min 時(shí)達(dá)到最大，但繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)反而下降，其原因可能為多糖結(jié)構(gòu)和性質(zhì)在較長(zhǎng)時(shí)間的超聲?微波作用下可降解為單糖［19?20］。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇10、15、20 min進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

3.2 響應(yīng)面法優(yōu)化 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇液料比（A）、超聲功率（B）、微波功率（C）、協(xié)同時(shí)間（D） 作為影響因素，多糖得率（Y） 作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，響應(yīng)面法［21］優(yōu)化提取工藝。因素水平見(jiàn)表1，結(jié)果見(jiàn)表2。

圖4 協(xié)同時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Fig.4 Effect of synergistic time on polysaccharides yield

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Design and results for tests

通過(guò)Design?Expertv8.0.6 軟件進(jìn)行擬合，得到二次回歸方程為Y＝0.57＋0.100A-0.28B-0.062C-0.4D-0.28AB＋0.21AC＋0.28AD-0.11BC＋0.18BD-0.070CD-0.31A2-0.85B2-1.42C2-0.99D2，模型決定系數(shù)R2＝0.992 2，調(diào)整系數(shù)＝0.984 5，均接近于1，表明模型一致性良好；變異系數(shù)為3.06%，表明模型擬合程度理想，方差分析見(jiàn)表3。由此可知，模型P＜0.000 1，表明它有顯著意義；失擬項(xiàng)P＞0.05，表明失擬程度不顯著；各因素影響程度依次為協(xié)同時(shí)間＞超聲功率＞液料比＞微波功率，B、D、AB、AD、A2、B2、C2、D2有顯著影響（P＜0.05，P＜0.01），表明該模型能用于預(yù)測(cè)。響應(yīng)面分析見(jiàn)圖5。

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

圖5 各因素響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots for various factors

通過(guò)Design?Expert8.0.6 軟件進(jìn)行擬合，得到最優(yōu)工藝為液料比25.49 ∶1，超聲功率139.3 W，微波功率250.19 W，協(xié)同時(shí)間13.82 min，桑葉多糖得率為5.264 6%，為了便于實(shí)際操作，將其修正為液料比25 ∶1，超聲功率139 W，微波功率250 W，協(xié)同時(shí)間14 min。對(duì)上述優(yōu)化工藝進(jìn)行3批驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得桑葉多糖平均得率為5.19%，與預(yù)測(cè)值5.264 6%接近，表明模型穩(wěn)定可靠。再將本實(shí)驗(yàn)所用的超聲?微波協(xié)同提取與熱水浸提［5］、微波提?。?］、超聲提?。?］進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表4，可知該方法提取時(shí)間更短，多糖得率更高。

表4 4 種提取方法比較Tab.4 Comparison of four extraction methods

3.3 抗氧化活性研究 圖6 顯示，多糖溶液質(zhì)量濃度與DPPH 自由基清除率呈正比，IC50為0.513 2 mg／mL，表明它具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

圖6 多糖對(duì)DPPH 自由基的清除作用Fig.6 Scavenging effect of polysaccha?rides on DPPH free radical

4 討論

桑葉多糖主要由葡萄糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖等組成［22］，具有明顯的免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、降血糖等作用。桑葉作為我國(guó)傳統(tǒng)中藥，具有安全性好、無(wú)不良反應(yīng)的優(yōu)點(diǎn)，而且資源豐富，在醫(yī)藥方面的應(yīng)用越來(lái)越受到重視，多糖作為其主要活性成分之一，目前相關(guān)研究主要集中在單糖組成、糖苷鍵類型、分子極性，鮮有涉及提取工藝。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行超聲?微波協(xié)同提取桑葉多糖，該方法操作簡(jiǎn)單，提取時(shí)間短，多糖得率高，最優(yōu)工藝為液料比25 ∶1，超聲功率139 W，微波功率250 W，協(xié)同時(shí)間14 min，平均得率為5.19%。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果顯示，該工藝合理可行，準(zhǔn)確穩(wěn)定，可為桑葉多糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

現(xiàn)代研究表明，桑葉多糖能有效減少體內(nèi)氧自由基及脂褐質(zhì)［23］；本實(shí)驗(yàn)對(duì)該成分抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)它具有明顯的清除DPPH 自由基能力，IC50為0.513 2 mg／mL。由此可知，超聲?微波協(xié)同提取的桑葉多糖具有較好的抗氧化活性，可為相關(guān)藥物的研發(fā)提供參考。