HPLC-MS法測(cè)定黃芪中黃酮類成分的含量

陳春茗，龔 姍，陳 蕾，馬丹鳳

(1 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007；2 湖南省兒童醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007)

黃芪為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根，具有補(bǔ)氣固表、利尿消腫、斂瘡生肌等功效，在表虛自汗、陰虛盜汗、陽氣虛弱、肺氣虛、中氣下陷、食少便溏、子宮脫垂等癥上有較高藥用價(jià)值[1-2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃芪含有皂苷類、黃酮及多糖類成分，具有增強(qiáng)免疫功能、調(diào)節(jié)血壓、抗菌、抗病毒、清除氧自由基、保護(hù)血管內(nèi)皮功能、保肝、抗心肌缺血等多種藥理作用[3-4]。黃芪藥材中可分離出幾十余種黃酮類成分，常見的有槲皮素、毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、染料木苷等[5-6]。本研究采用HPLC-MS法測(cè)定了黃芪藥材中毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素等4種含量較高的黃酮類成分含量，以期為黃芪藥材質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀 器

API4000型三重四級(jí)桿質(zhì)譜，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)；1100型液相色譜儀，美國(guó)安捷倫公司；AL204型電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；DL-360D超聲波清洗器，上海之信儀器有限公司。

1.2 試 藥

毛蕊異黃酮苷對(duì)照品(批號(hào)：15111012)、芒柄花苷對(duì)照品(批號(hào)：15041223)、毛蕊異黃酮對(duì)照品(批號(hào)：15090324)、芒柄花素(批號(hào)：15080717)均購(gòu)買自廣州牌牌生物科技有限公司，純度均>98%；乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純，購(gòu)自美國(guó)邁瑞達(dá)科技有限公司；水為去離子水。8批黃芪藥材來源于不同產(chǎn)地，經(jīng)筆者鑒定均為蒙古黃芪，見表1。

表1 黃芪藥材來源與品種

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Acclaim 120 C18，戴安公司，2.1×100 mm，5 μm；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.3%甲酸溶液(B)，梯度洗脫(0～10 min，18%～20% A；10～35 min，20%～24% A；35～52 min，24%～27% A；52～60 min，27%～34% A；60～65 min，34%～40% A；65～70 min，40%～50% A)；流速：1.0 mL/min；柱溫：檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，進(jìn)樣量：20 μL，柱溫25 ℃。HPLC圖譜如圖1所示。

2.2 質(zhì)譜條件

離子模式：電噴霧離子源(ESI)；噴霧電壓：241 kV；離子源溫度：350 ℃；以氮?dú)鉃楦稍餁?，流速?.5 L/min。掃描模式為選擇離子監(jiān)測(cè)(SIM)，定量分析監(jiān)測(cè)離子有毛蕊異黃酮苷m/z 445.11[M-H]-、芒柄花苷m/z 429.12 [M-H]-、毛蕊異黃酮m/z 283.06[M-H]-、芒柄花素m/z 267.07[M-H]-。

2.3 溶液的制備

2.3.1 混合對(duì)照品溶液

精密稱定各待測(cè)成分對(duì)照品適量，加甲醇溶解，搖勻，制成混合對(duì)照品溶液，毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素質(zhì)量濃度分別為0.22、0.13、0.07、0.05 mg/mL。

2.3.2 供試品溶液

取樣品適量，粉碎(過4號(hào)篩)，精密稱定1.0 g，加甲醇100 mL，回流提取1.5 h，減壓濃縮，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶，以甲醇定容至刻度，充分搖勻，再用0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

3 結(jié)果與討論

3.1 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

取“2.3.1”項(xiàng)下配制混合對(duì)照品溶液適量，進(jìn)樣測(cè)定(按“2.1”項(xiàng)色譜條件)，得到HPLC圖譜，見圖1。結(jié)果顯示，毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素保留時(shí)間分別為9.24 min、26.08 min、38.56 min、65.73 min，各成分均達(dá)到基線分離，峰形良好，理論板數(shù)均>1.5。

圖1 混合對(duì)照品(A)和供試品(B)的HPLC圖譜

3.2 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.3.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1、5、10、50 μL，進(jìn)樣測(cè)定(按“2.1”項(xiàng)色譜條件)，記錄峰面積。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度(x,mg/mL)為橫坐標(biāo)，以峰面積(y)為縱坐標(biāo)，做線性回歸，得回歸方程、線性范圍，見2。

表2 回歸方程及線性范圍

3.3 精密度實(shí)驗(yàn)

取“2.3.1”項(xiàng)下配置的混合對(duì)照品溶液適量，進(jìn)樣測(cè)定(按“2.1”項(xiàng)色譜條件)，連續(xù)進(jìn)行6次測(cè)定，記錄峰面積并分析，結(jié)果顯示，毛蕊異黃酮苷RSD為0.23%，芒柄花苷RSD為0.56%，毛蕊異黃酮RSD為0.37%，芒柄花素RSD為0.18%，說明該方法具有良好精密度。

3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取“2.3.2”項(xiàng)下配制的供試品溶液適量，室溫下放置，并分別于0、4、8、12、18、24 h進(jìn)行測(cè)定(按“2.1”項(xiàng)色譜條件)，分析峰面積并分析，結(jié)果顯示，毛蕊異黃酮苷RSD為0.15%，芒柄花苷RSD為0.27%，毛蕊異黃酮RSD為0.41%，芒柄花素RSD為0.22%，說明供試品溶液在室溫下放置24 h具有良好穩(wěn)定性。

3.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

配制供試品溶液(按“2.3.2”項(xiàng)相關(guān)方法)，共制備6份，進(jìn)樣測(cè)定，色譜條件按“2.1”項(xiàng)，記錄峰面積并進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果顯示，毛蕊異黃酮苷含量為0.4212%，RSD為0.0842%；芒柄花苷含量為0.5187%，RSD為0.7923%；毛蕊異黃酮含量為0.2269%，RSD為0.0768%；芒柄花素含量為0.6582%，RSD為0.9228%；說明該方法具有良好重復(fù)性。

3.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取已知含量的樣品約0.5 g，共6份，并分別加入一定量待測(cè)成分對(duì)照品，配制供試品溶液(按“2.3.2”項(xiàng)下方法)，進(jìn)樣測(cè)定(按“2.1”項(xiàng)下色譜條件)，計(jì)算加樣回收率，見表3。

表3 加樣回收率試驗(yàn)(%)

3.7 樣品測(cè)定

8批黃芪藥材，各取適量，配制供試品溶液(按“2.3.2”項(xiàng)下方法)，進(jìn)行測(cè)定(按“2.1”項(xiàng)下色譜條件)，記錄峰面積，計(jì)算各黃酮成分含量。見表4。

表4 黃芪藥材中黃酮成分含量測(cè)定結(jié)果(n=3，mg/g)

3.8 檢測(cè)方法選擇

在前期條件摸索過程中，嘗試以HPLC-DAD法測(cè)定黃芪中黃酮類成分含量，發(fā)現(xiàn)黃芪中芒柄花苷與毛蕊異黃酮等成分相互干擾不能實(shí)現(xiàn)完全分離。而HPLC-MS法選擇性及靈敏度均較好，同時(shí)不要求待測(cè)成分達(dá)到完全分離，這對(duì)分析含有多種有效成分的中藥有著明顯優(yōu)勢(shì)[7]，因此選擇HPLC-MS法測(cè)定黃芪藥材中黃酮成分含量。本研究應(yīng)用的SIM模式較多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式專屬性要低，使得一些待測(cè)成分在獲取的離子流圖中可出現(xiàn)多個(gè)色譜峰。對(duì)此，試驗(yàn)中測(cè)定了成分色譜峰的保留時(shí)間，以解決這一不足。

3.9 質(zhì)譜條件優(yōu)化

在待測(cè)成分的質(zhì)譜條件選擇優(yōu)化過程中發(fā)現(xiàn)，毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素等負(fù)離子檢測(cè)模式下響應(yīng)較好，故而選擇負(fù)離子模式對(duì)黃芪中藥中上述四種黃酮成分含量進(jìn)行測(cè)定。

3.10 流動(dòng)相考察

黃芪中黃酮類成分多呈弱酸性，因此應(yīng)選擇酸性緩沖系統(tǒng)[8]，本研究分別對(duì)乙腈-磷酸、乙腈-甲酸系統(tǒng)進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)抑制劑選用甲酸，黃酮各成分能夠得到較好分離。同時(shí)還評(píng)估多種梯度流動(dòng)相配比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以乙腈(A)-0.3%甲酸溶液(B)為流動(dòng)相系統(tǒng)，梯度洗脫(0～10 min，18%～20% A；10～35 min，20%～24% A；35～52 min，24%～27% A；52～60 min，27%～34% A；60～65 min，34%～40% A；65～70 min，40%～50% A)時(shí)4種黃酮類成分分離效果最好，色譜峰間分離度均在1.5以上，因而選擇乙腈-0.3%甲酸溶液為流動(dòng)相。

3.11 提取方法選擇

有報(bào)道指出，在黃芪總黃酮提取上，連續(xù)回流提取法較超聲法有著節(jié)省溶劑、操作迅速、獲取有效成分高等多種優(yōu)勢(shì)[9]。本研究觀察評(píng)估了超聲法、冷浸法、回流法等三種提取方法，發(fā)現(xiàn)回流提取明顯優(yōu)于其他兩種提取方法。此外，本研究還就不同提取時(shí)間進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)回流1.5 h后，隨著回流繼續(xù)進(jìn)行，毛蕊異黃酮、芒柄花素的峰面積逐漸減小，提示上述兩種黃酮成分可能具有熱不穩(wěn)定性。故選擇回流提取1.5 h進(jìn)行黃芪中黃酮成分的提取。

3.12 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

有研究顯示，毛蕊異黃酮苷與毛蕊異黃酮的最大吸收波長(zhǎng)為258 nm，而肩縫處于288 nm波長(zhǎng)；芒柄花苷、芒柄花素最大吸收波長(zhǎng)為248 nm，而肩峰處于290 nm[10-11]。采用二極管陣列檢測(cè)器全波長(zhǎng)對(duì)供試品溶液進(jìn)行掃描，獲取指紋圖譜，以盡可能涵蓋所有吸收峰為原則，發(fā)現(xiàn)各黃酮類成分在254 nm時(shí)，峰形及峰面積較好，因此選擇254 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

4 結(jié) 論

本研究建立HPLC-MS法同時(shí)測(cè)定黃芪中毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素等黃酮類成分，具有較高的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性，且該法操作簡(jiǎn)便、迅速，可作為黃芪藥材中黃酮類成分含量測(cè)定的質(zhì)控手段。