四環(huán)素對孤雌產(chǎn)雌松毛蟲赤眼蜂生殖表型及適合度的影響

霍梁霄，周金成，張 琛，趙 倩，董 輝

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，沈陽 110161)

Wolbachia是一類廣泛分布于節(jié)肢動物類群和線蟲中、隨母系遺傳的專性胞內(nèi)共生菌(Werrenetal.，2008)。Wolbachia能夠調(diào)控宿主生殖表型改變，主要包括：細(xì)胞質(zhì)不親和(Cytoplasmic Incompatibility，CI)、雌性化(Feminization)、殺雄(Male Killing，MK)和誘導(dǎo)孤雌產(chǎn)雌生殖(Parthenogenesis Induction，PI)(Werren，1997；施婉君等，2002)。另一方面，Wolbachia還影響雄性黑腹果蠅Drosophilamelanogaster的侵略性(Rohrscheibetal.，2015)和活躍狀態(tài)(Vale and Jardine，2015)、提高宿主的免疫力(Hedgesetal.，2008)、參與到縮基反顎繭蜂Asobaratabida的卵子發(fā)生過程(Dedeineetal.，2005)和提高松毛蟲赤眼蜂Trichogrammadendrolimi的功能反應(yīng)(Dongetal.，2017)。通過利用Wolbachia對宿主的這些調(diào)控作用，可以實(shí)現(xiàn)對宿主生物的改造，從而達(dá)到控制有害生物或提高天敵防治潛力的作用(Werrenetal.，2008；Brucker and Bordenstein，2012；Le Page and Bordenstein，2013)。因此，Wolbachia與宿主之間的互作一直是近年來研究的熱點(diǎn)。

由于胞內(nèi)共生菌Wolbachia無法在宿主細(xì)胞外生存，這種特性增加了研究共生菌Wolbachia的困難(Werrenetal.，2008)。一般而言，通過抗生素處理能夠獲得Wolbachia去除或滴度降低的宿主種群，可用以研究Wolbachia對宿主的調(diào)控作用。目前，最常用的抗生素是四環(huán)素，其次是利福平(Lietal.，2014)。Dobsonetal.(2002)借助四環(huán)素探究了Wolbachia對宿主白紋伊蚊Aedesalbopictus的影響。Wangetal.(2017)通過四環(huán)素處理麗蚜小蜂EncarsiaFormosa，證明Wolbachia密度可以影響宿主的性別決定。Almeidaetal.(2010)利用利福平去除一種赤眼蜂T.atopovirilia體內(nèi)的Wolbachia，用以研究Wolbachia對宿主行為的影響。高溫、密集飼養(yǎng)和營養(yǎng)脅迫處理也能夠降低Wolbachia滴度(Wiwatanaratanabutr and Kittayapong，2009；Zhuetal.，2012；Rossetal.，2016)，但這些方法均不如抗生素處理普遍。研究者們大多只關(guān)注抗生素處理后對Wolbachia介導(dǎo)下宿主相關(guān)表型的影響，然而抗生素處理也可能對宿主的適合度產(chǎn)生影響。抗生素處理下宿主適合度的變化以及宿主體內(nèi)Wolbachia滴度的變化均有可能影響宿主表型。為排除抗生素對宿主的“附加效應(yīng)”，抗生素處理感染宿主時應(yīng)當(dāng)考慮對宿主適合度的潛在影響。

赤眼蜂是一種廣泛應(yīng)用于生物防治的鱗翅目害蟲卵期寄生蜂，其性別決定方式為單雙倍體決定型，即二倍體受精卵可發(fā)育為雌蜂，未受精的單倍體卵可發(fā)育為雄蜂(潘雪紅等，2007)。然而，Wolbachia可誘導(dǎo)赤眼蜂發(fā)生孤雌產(chǎn)雌生殖現(xiàn)象(Stouthameretal.，1993；Arakakietal.，2000；Russell and Stouthamer，2011；Reumeretal.，2012)，即未受精的卵恢復(fù)二倍體發(fā)育成雌蜂。前人研究發(fā)現(xiàn)抗生素處理可以恢復(fù)感染赤眼蜂的兩性生殖(Stouthameretal.，1990)，但是抗生素對赤眼蜂適合度的影響尚不清楚。本研究采用不同濃度的四環(huán)素連續(xù)飼喂產(chǎn)雌孤雌生殖的松毛蟲赤眼蜂5個世代，觀察統(tǒng)計各世代下不同濃度四環(huán)素處理后松毛蟲赤眼蜂的繁殖力(黑卵數(shù))、羽化率(羽化出蜂的數(shù)量占黑卵數(shù)的比值)及子代雄蜂比(子代雄蜂占子代數(shù)量的比值)，探究四環(huán)素處理對松毛蟲赤眼蜂適合度的影響，為研究Wolbachia與寄主之間相互作用的機(jī)制提供一種技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料

產(chǎn)雌孤雌生殖的松毛蟲赤眼蜂及其寄主米蛾Corcyracephalonica均來自于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)昆蟲與害蟲生物防治實(shí)驗室。孤雌產(chǎn)雌生殖的松毛蟲赤眼蜂由人工轉(zhuǎn)染W(wǎng)olbachia獲得，并用新鮮米蛾卵在室內(nèi)(25±1℃，RH 75%±5%，16 L ∶8 D)連續(xù)飼養(yǎng)多代。

寄主米蛾在養(yǎng)蟲室內(nèi)(25±1℃，RH 75%±5%，16 L ∶8 D)用面粉繁育多代。試驗前取新鮮的米蛾卵(<24 h)粘在涂有阿拉伯樹膠的白色紙卡上，制成米蛾卵卡。米蛾卵卡用紫外燈照射處理40 min，以便殺死胚胎防止米蛾卵孵化吃掉被寄生的卵，影響實(shí)驗結(jié)果。處理后的米蛾卵卡供松毛蟲赤眼蜂寄生。試驗所用的四環(huán)素購于大連寶生物公司，所用蜂蜜為荊條蜂蜜，購自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)沈農(nóng)寶蜂蜜有限公司。

1.2 方法

將50 mg、150 mg、250 mg四環(huán)素分別溶于10 mL 50%蜂蜜水，配制成四環(huán)素濃度分別為5 mg/mL、15 mg/mL、25 mg/mL抗生素-蜂蜜水溶液,存于4℃冰箱中備用。

隨機(jī)選取羽化時間一致(<24 h)的赤眼蜂作為供試蜂，供試蜂分為4組，每組設(shè)20個重復(fù)，其中1組為對照組，喂食不含四環(huán)素的50%蜂蜜水；其余3組分別喂食含有濃度為5 mg/mL、15 mg/mL、25 mg/mL四環(huán)素的蜂蜜水。為保證供試蜂能夠充分接觸并取食蜂蜜水，預(yù)先用與指型管等長的棉線蘸取蜂蜜水后移入指型管(直徑1.0 cm，長度4.5 cm)，保證棉線沿管口至管底延伸，使隨后接入的供試蜂能夠充分接觸并取食棉線上的蜂蜜水。供試蜂引入至指型管喂食蜂蜜水12 h后，把米蛾卵卡(卡上約100粒卵)放入指型管內(nèi)，供其寄生。為防止羽化出的子代雄蜂與子代雌蜂交配，被寄生的米蛾卵從最初的淡黃色變成黑色(赤眼蜂正在蛹期)，將單粒黑卵剪下置于指形管中，剩下的黑卵置于原指形管中。赤眼蜂羽化后(F1代)，對單粒黑卵羽化的雌蜂重復(fù)上述操作至F5代。統(tǒng)計各世代下赤眼蜂的繁殖力(黑卵數(shù))。根據(jù)觸角形態(tài)和外生殖器鑒定子代性別，在雙目顯微鏡下觀察并記錄各世代下子代性別及子代個數(shù)。統(tǒng)計各世代松毛蟲赤眼蜂羽化數(shù)、羽化率(羽化出蜂的數(shù)量占黑卵數(shù)的比值)、雄蜂數(shù)、雄蜂率(子代雄蜂占子代數(shù)量的比值)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗結(jié)果采用雙因素方差分析，檢驗了不同世代下的四環(huán)素不同濃度處理對松毛蟲赤眼蜂繁殖力、羽化率以及雄性比的影響。采用Breusch-Pagan檢驗對數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差一致性假定進(jìn)行檢驗。各世代下不同四環(huán)素處理下各試驗指標(biāo)間的多重比較采用Duncan’s新復(fù)極差檢驗。所有數(shù)據(jù)結(jié)果采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 四環(huán)素和處理世代對繁殖力的影響

與對照組相比，各世代中不同濃度四環(huán)素處理的雌蜂繁殖力均顯著降低(P< 0.05)(圖1)。不同世代的對照組雌蜂繁殖力無顯著差異，在60～70粒之間。四環(huán)素不同濃度和處理世代對雌蜂繁殖力具有交互作用影響。在F1代、F2代和F5代中，雌蜂繁殖力隨四環(huán)素濃度的增加而下降，但在F3代和F4代中，抗生素濃度對雌蜂繁殖力無顯著差異(P> 0.05)。各世代下雌蜂繁殖力在F2代達(dá)到最高，但在F3代達(dá)到最低。

圖1 四環(huán)素濃度和處理世代對繁殖力的影響Fig.1 The fecundity as influenced by tetracycline concentrations and treatment generations注：圖中誤差柄為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。不同字母表示各世代下不同濃度四環(huán)素處理下的繁殖力在0.05水平上差異顯著性。Note: The errorbars represent the Mean±SE. Different letters represent the significant difference of fecundity in each concentration in the same generation at 0.05 level.

2.2 四環(huán)素和處理世代對子代羽化率的影響

與對照組相比，各世代中不同濃度四環(huán)素處理對子代羽化率的影響不具有一致性(圖2)，F(xiàn)2和F4代四環(huán)素處理的子代羽化率顯著低于相應(yīng)對照組(P< 0.05)，但F1、F3和F5代四環(huán)素處理的子代羽化率與對照組相比無顯著差異(P>0.05)。各世代相應(yīng)對照組的子代羽化率基本一致，其子代羽化率在80%到90%之間。在F2代中，5 mg/mL的四環(huán)素處理后，子代羽化率最低，為64.87%±1.14%。在F4代中，15 mg/mL和25 mg/mL的四環(huán)素處理后，子代羽化率最低，分別為60.03%±2.33%和58.43%±2.33%。

圖2 四環(huán)素濃度和處理世代對子代羽化率的影響Fig.2 The emergence rate of offsprings as influenced by tetracycline concentrations and treatment generations注：圖中誤差柄為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。不同字母表示各世代下不同濃度四環(huán)素處理下的羽化率在0.05水平上差異顯著性。Note: The errorbars represent the Mean±SE. Different letters represent the significant difference of emergence rate in each concentration in the same generation at 0.05 level.

2.3 四環(huán)素和處理世代對子代雄性比的影響

不同濃度四環(huán)素連續(xù)處理松毛蟲赤眼蜂5代后，各世代下均出現(xiàn)了雄性后代(圖3)。在F1代中，15 mg/mL的四環(huán)素處理的子代雄性比達(dá)到最高，為6.07%±1.87%，其余濃度處理組子代雄性比與對照組之間無顯著差異(P>0.05)。相同濃度的四環(huán)素處理下，F(xiàn)2代子代雄性比顯著高于F1代(P< 0.05)。F2代中，各濃度處理組的子代雄性比之間無顯著差異(P>0.05)。相同四環(huán)素處理濃度下，F(xiàn)3代子代雄性較F2進(jìn)一步顯著上升(P< 0.05).在F3代中，5 mg/mL和15 mg/mL四環(huán)素處理的子代雄性比較高，分別為33.28%±7.08%和33.03%±6.64%。F4代中，5 mg/mL和15 mg/mL四環(huán)素處理的子代雄性比與F3代相比無顯著差異(P>0.05)，但25 mg/mL四環(huán)素處理的子代雄性比達(dá)到最高，為87.02%±5.40%。F5代中，5 mg/mL和15 mg/mL四環(huán)素處理的子代雄性比與F3和F4代相比又進(jìn)一步上升(P< 0.05),但25 mg/mL四環(huán)素處理的子代雄性比與F4代相比顯著下降(P< 0.05)。

圖3 四環(huán)素濃度和處理世代對子代雄性比的影響Fig.3 The male ratio of offsprings as influenced by tetracycline concentrations and treatment generations注：圖中誤差柄為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。不同字母表示各世代下不同濃度四環(huán)素處理下的雄性比在0.05水平上差異顯著性。Note: The errorbars represent Mean±SE. Different letters represent the significant difference of male ratio in each concentration in the same generation at 0.05 level.

3 結(jié)論與討論

從恢復(fù)松毛蟲赤眼蜂兩性生殖表型的角度上，不同濃度四環(huán)素處理松毛蟲赤眼蜂1個世代并不能達(dá)到預(yù)期效果。較低濃度的四環(huán)素對松毛蟲赤眼蜂兩性生殖表型的恢復(fù)效果(子代雄性比)隨處理世代增加而提升。然而，高濃度四環(huán)素處理下，松毛蟲赤眼蜂兩性生殖表型的恢復(fù)效果在前4個世代中隨處理世代的增加而上升，但在第5個世代中子代雄性比回落?？傮w而言，各濃度四環(huán)素連續(xù)處理2個世代后才會對松毛蟲赤眼蜂兩性生殖表型有顯著的恢復(fù)作用。在恢復(fù)松毛蟲赤眼蜂兩性生殖表型的條件下，還需進(jìn)一步選擇對松毛蟲赤眼蜂適合度影響最小的四環(huán)素處理方式。

本文通過研究繁殖力和羽化率來檢驗抗生素對松毛蟲赤眼蜂的“附加效應(yīng)”。在松毛蟲赤眼蜂恢復(fù)兩性生殖表型的基礎(chǔ)上，從繁殖力角度上看，四環(huán)素連續(xù)處理赤眼蜂2個世代對雌蜂繁殖力影響最小。四環(huán)素對雌蜂繁殖力的影響隨世代的增加具有累加效應(yīng)(圖1)。從松毛蟲赤眼蜂子代的致死作用(羽化率)的結(jié)果得知，四環(huán)素連續(xù)處理雌蜂3個世代對松毛蟲赤眼蜂羽化率影響最小(圖2)。因此，綜合抗生素對羽化率和繁殖力的影響，應(yīng)當(dāng)選用較低的抗生素濃度處理松毛蟲赤眼蜂2個世代或3個世代。

業(yè)已證明，抗生素可以用于降低宿主體內(nèi)的Wolbachia滴度，進(jìn)而削弱Wolbachia對宿主生殖表型的調(diào)控能力。因此，通過抗生素處理的宿主能夠用于確定Wolbachia調(diào)控宿主相關(guān)表型表達(dá)的一種技術(shù)手段。Maetal.(2015)研究發(fā)現(xiàn)一種產(chǎn)雌孤雌的寄生蜂A.japonica的子代雄蜂比例隨著Wolbachia滴度的降低而增加。有研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)雌孤雌生殖的麗蚜小蜂子代雄性比例也隨著Wolbachia滴度降低而增加(Stouthamer and Mak，2002)。在赤眼蜂中，這類現(xiàn)象也已被證明。陳茜等(2016)發(fā)現(xiàn)產(chǎn)雌孤雌生殖的食胚赤眼蜂T.embryophagum雄蜂比例隨著Wolbachia滴度的降低而增加。許多這類研究均指出，Wolbachia滴度與控制宿主生殖表型的表達(dá)之間存在正相關(guān)關(guān)系(Breeuwer and Werren，1993；Bourtzisetal.，1996；Zchori-Feinetal.，2000；Ikedaetal.，2003；Pascaletal.，2004)。Stouthamer(1997)認(rèn)為通過抗生素等手段降低宿主體內(nèi)的Wolbachia滴度，可以削弱Wolbachia對宿主卵細(xì)胞第一次有絲分裂的干擾作用，使胚胎配子復(fù)制失敗，進(jìn)而使宿主仍然維持胚胎染色體的單倍狀態(tài)，最終發(fā)育為雄性個體。

從結(jié)果中發(fā)現(xiàn)四環(huán)素處理孤雌產(chǎn)雌生殖的的松毛蟲赤眼蜂后，雌蜂繁殖力低于對照組，各世代下雌蜂繁殖力隨四環(huán)素濃度的增加而下降。四環(huán)素能夠影響松毛蟲赤眼蜂的寄生功能，導(dǎo)致雌蜂寄生能力降低。造成這種結(jié)果的原因可能由于以下三個方面：(1)四環(huán)素處理感染宿主可以引起Wolbachia滴度的變化，導(dǎo)致感染宿主的適合度發(fā)生改變?；驔_突假說認(rèn)為，在宿主胚胎中，Wolabchia和宿主基因存在博弈關(guān)系。單倍體宿主的核基因仍然趨向于使宿主發(fā)育為雄性子代，而Wolbachia趨向于使宿主第一次有絲分裂失敗，促使胚胎染色體加倍。雙方的這種競爭關(guān)系將造成宿主產(chǎn)生一定的適合度代價，而較低的Wolbachia滴度將使這種“拉鋸戰(zhàn)”的時間延長，進(jìn)而對宿主適合度造成負(fù)面影響，甚至使宿主胚胎“敗育”。有研究表明，在這種博弈關(guān)系下，孤雌產(chǎn)雌生殖的赤眼蜂胚胎的流產(chǎn)率顯著高于兩性生殖的赤眼蜂胚胎(Tagamietal.，2001)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，Wolbachia感染下的蜆蝶赤眼蜂T.kaykai的繁殖率和羽化率均顯著降低(Hohmannetal.，2001；Miura and Tagami，2004)。Liuetal.(2018)發(fā)現(xiàn)Wolbachia對松毛蟲赤眼蜂的適合度存在負(fù)面影響。(2)四環(huán)素的作用機(jī)制為阻斷原核生物30S核糖體亞基，進(jìn)而抑制轉(zhuǎn)錄及蛋白合成。因此，四環(huán)素可能對宿主線粒體的蛋白質(zhì)合成產(chǎn)生抑制作用(Zhangetal.，2005)。前人研究發(fā)現(xiàn)四環(huán)素會降低擬果蠅D.simulans體內(nèi)線粒體的功能，減少宿主ATP產(chǎn)物的合成，從而影響擬果蠅的生殖力和壽命(Ballard and Melvin，2007)。(3)抗生素在清除Wolbachia靶標(biāo)微生物的同時，可能也對宿主體內(nèi)的其他共生微生物產(chǎn)生負(fù)面影響，導(dǎo)致宿主體內(nèi)菌群失衡。一些共生菌也可能與宿主共用代謝通路，參與宿主維生素及其他營養(yǎng)成分的合成(Lvetal.，2018)。因此，抗生素處理感染宿主時，應(yīng)充分考慮抗生素處理的非靶標(biāo)作用。

根據(jù)研究結(jié)果推測，在特定抗生素濃度處理下，隨抗生素處理宿主代數(shù)的增加，抗生素也可能對宿主產(chǎn)生毒物興奮作用(Daviesetal.，2006；Linaresetal.，2006；Miglioreetal.，2013)。宿主可能在前期對抗生素的適應(yīng)性較差，但隨處理世代的增加，宿主赤眼蜂體內(nèi)解毒功能逐步激活，適合度有所恢復(fù)。然而，宿主對適合度的恢復(fù)能力可能不具有持續(xù)性，若繼續(xù)增加處理世代數(shù)，其適合度變化將再次出現(xiàn)反復(fù)。根據(jù)赤眼蜂羽化率的變化情況，推測四環(huán)素處理感染W(wǎng)olbachia的赤眼蜂后，各世代下的雌蜂對不同四環(huán)素濃度的耐受能力不同，雌蜂在低濃度的抗生素條件下能夠進(jìn)行自我修復(fù)一部分損傷，而高濃度抗生素處理對宿主造成的損傷具有不可逆性。

通過抗生素處理宿主來研究共生菌對宿主相應(yīng)功能表型的影響是一種模式方法。但在進(jìn)行這類研究中，應(yīng)當(dāng)考慮排除或降低抗生素對宿主生殖表型影響之外的非靶標(biāo)作用影響。本研究將對這類研究方法的嚴(yán)謹(jǐn)性和科學(xué)性提供新的工作思路和數(shù)據(jù)支持。在抗生素使用量能夠恢復(fù)松毛蟲赤眼蜂兩性生殖表型的基礎(chǔ)上，本試驗結(jié)果能夠為四環(huán)素去除Wolbachia提供推薦使用量和使用方法，從而使抗生素對宿主赤眼蜂的“附加效應(yīng)”影響最小。關(guān)于抗生素的使用量還有待于明確，有關(guān)這類研究應(yīng)當(dāng)更加全面和深入的開展。