蚊蟲組學(xué)研究進(jìn)展

吳 恙，周騰飛，賴澤鈿，謝李華，謝雨谷，劉培文，劉 通，楊文強，金彬彬，孔 翎，郭怡佳，趙宜潔，鄧潔琳，顧金保，陳曉光

(南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院病原生物學(xué)系暨廣東省熱帶病防治研究重點實驗室，廣州 510515)

蚊是一類重要的醫(yī)學(xué)昆蟲，能吸血傳病，是多種疾病如登革熱、寨卡病毒病、瘧疾、流行性乙型腦炎等的傳播媒介，對人類的日常生活和生命健康危害極大。長期以來，由于蚊基因組中高度重復(fù)序列的存在，使得蚊蟲基因特別是非編碼序列的分子克隆和功能分析非常困難。近年來，隨著高通量測序和生物信息學(xué)技術(shù)的成熟和不斷革新，蚊蟲基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、小RNA組學(xué)等也取得了快速發(fā)展。本文對蚊組學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的研究進(jìn)展綜述如下。

1 基因組學(xué)研究

蚊基因組的解析和比較基因組分析有助于探索蚊基因組的結(jié)構(gòu)和功能。大多數(shù)蚊染色體數(shù)是2n=6，只有按蚊亞科夏蚊屬的Chagasiabathana染色體數(shù)2n=8 (Rao and Rai, 1987)。在常見的媒介蚊蟲中，按蚊屬Anopheles擁有X和Y染色體，這對性染色體的核型是不同的，被稱為異態(tài)性染色體(heteromorphic sex chromosomes)(Neafseyetal., 2015)；伊蚊屬Aedes、庫蚊屬Culex、阿蚊屬Armigeres擁有一對核型相同的性染色體，被稱為同態(tài)性染色體(homomorphic sex chromosomes)(McKee and Handel, 1993)。蚊染色體有大量的移位和顛換，其結(jié)構(gòu)和組成是蚊生物學(xué)性狀差異的基礎(chǔ)(Breland, 1961; Rai, 1999; Toups and Hahn, 2010)。近年來，隨著第二代測序、第三代測序、HiC染色體構(gòu)象捕獲、Bionano光學(xué)圖譜等生物技術(shù)的快速發(fā)展和日益成熟，目前已公開發(fā)表了22種蚊的基因組，其中包括19種按蚊屬、2種伊蚊屬和1種庫蚊屬。

1.1 蚊基因組組成

蚊基因組具有明顯的多樣性，表現(xiàn)在相對高比例的單拷貝、中等重復(fù)和高度重復(fù)的序列，導(dǎo)致蚊種間基因組大小有大約8倍的變異。按蚊約為0.24～0.29 pg，巨蚊屬Toxorhynchites和煞蚊屬Sabethes基因組為中等大小(0.62 pg)，而庫蚊屬0.54～1.02 pg，脈毛蚊屬Culiseta為0.92～1.25 pg，騷擾阿蚊Armigeressubalbatus和Heamagogusequinius分別為1.24 pg和1.12 pg；作為全世界廣泛分布的伊蚊，其核DNA量變化超過3倍；波利尼西亞的兩種伊蚊基因組最小，僅0.59 pg；Ochlerotatuszoosophus則具有最大的基因組(1.9 pg)(Besansky and Collins, 1992; Severson and Behura, 2012; Bonizzonietal., 2013)。一般來說，在進(jìn)化關(guān)系中，基因組大小隨著蚊科進(jìn)化而增加。

在按蚊亞科，大約60%～80%的基因組是單拷貝序列(Neafseyetal., 2015)，而庫蚊亞科大多數(shù)是中等和高度的重復(fù)序列(Neneetal., 2007; Arensburgeretal., 2010; Chenetal., 2015; Matthewsetal., 2018)。蚊基因組組成的基本形式是短周期性散點式(short-period interspersion)，單拷貝序列長度為1 000～2 000 bp，交替出現(xiàn)短的(200～600 bp)和中等長度(1 000～4 000 bp)的重復(fù)序列，這在庫蚊亞科中是普遍現(xiàn)象(Neneetal., 2007; Arensburgeretal., 2010; Chenetal., 2015; Matthewsetal., 2018)；另一種形式是長周期性散點式(long-period interspersion)，長的(≥5 600 bp)和極長的(≥13 000 bp)重復(fù)交替不間斷地出現(xiàn)，這在按蚊亞科中是普遍現(xiàn)象(Neafseyetal., 2015)。

按蚊亞科和庫蚊亞科基因組組成的差別對于應(yīng)用多線染色體物理作圖以及應(yīng)用核糖體分子標(biāo)志進(jìn)行分類有重要的影響。在已經(jīng)研究多線染色體的蚊屬中，僅按蚊屬具有染色中心(chromocenter)，而伊蚊屬、庫蚊屬、曼蚊屬、巨蚊屬、直腳蚊屬Orthopodomyia及懷蚊屬Wyeomyia缺少明顯的染色中心(Munstermannetal., 1985; Coluzzietal., 2002; Camposetal., 2003a; Camposetal., 2003b)。按蚊亞科容易制備高質(zhì)量的多線染色體，被用于蟲種鑒定和物理作圖(Coluzzietal., 2002)。庫蚊亞科的多線染色體不易展開，可能與其基因組大量的重復(fù)序列易發(fā)生錯配有關(guān)，可用分裂中期的染色體進(jìn)行研究(Camposetal., 2003a)。此外，在按蚊中，用轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer, ITS)進(jìn)行蚊種鑒定能獲得較為穩(wěn)定的結(jié)果(Paskewitzetal., 1994)，而在庫蚊和伊蚊，由于存在較多的重復(fù)序列，用該標(biāo)志進(jìn)行蟲種鑒定，不易獲得重復(fù)穩(wěn)定的結(jié)果(Porter and Collins, 1991)。

1.2 蚊基因組測序

1.2.1蚊基因組

岡比按蚊An.gambiaePEST(Pink Eye STandard)基因組于2002年首次公布(Holtetal., 2002)，是9株野生株系經(jīng)人工雜交產(chǎn)生的實驗室品系，具有特征性的粉色眼，但該株系已于2005年遺失(Sharakhovaetal., 2007)。通過構(gòu)建該株系的細(xì)菌人工染色體(bacterial artificial chromosome, BAC)并進(jìn)行測序，以及近年來眾多研究者對其基因組不斷完善組裝，目前岡比按蚊PEST株基因組版本號為AgamP4，基因組大小約為273 Mb，Scaffold N50為49.4 Mb，包括8個scaffolds，分別為X染色體、2號染色體L臂、2號染色體R臂、3號染色體L臂、3號染色體R臂、Y染色體(未確定序列具體位置)、線粒體基因組和未知位置的序列(Holtetal., 2002; Sharakhovaetal., 2007)。

埃及伊蚊Ae.aegyptiLVP_AGWG(LiverpoolAedesGenome Working Group)株雄性基因組于2017年公布(Matthewsetal., 2018)，主要結(jié)合使用了PacBio第三代測序、HiC染色體構(gòu)象捕獲和Bionano光學(xué)圖譜等生物技術(shù)，基因組版本號為AaegL5，大小約為1.278 Gb，Scaffold N50為409.8 Mb，包括2310個scaffolds，其中最長的 3個 scaffolds分別為1號、2號和3號染色體。該版本的基因組組裝首次報道了埃及伊蚊1號染色體中的雄性決定區(qū)域(M-locus)，這段區(qū)域富含重復(fù)序列而少有編碼基因，功能和結(jié)構(gòu)類似于Y染色體，與埃及伊蚊雄性性別決定密切相關(guān)。

白紋伊蚊Ae.albopictus又名亞洲虎蚊，是一種最常見的入侵物種和媒介蚊蟲之一，并在全球有蔓延擴(kuò)散的風(fēng)險和趨勢，是寨卡病毒(Zika virus)、登革病毒(Dengue virus)、基孔肯雅病毒(Chikungunya virus)等病原的傳播媒介(Bonizzonietal., 2013)。白紋伊蚊佛山株(Foshan)是我國學(xué)者于1981年開始近交培育的實驗室品系，其基因組巨大，變異度高于0.5%，且重復(fù)序列非常多。為了攻克這些基因組研究中的技術(shù)難題，我國學(xué)者通過純化基因組背景，結(jié)合全基因組擴(kuò)增(whole genome amplification, WGA)，并構(gòu)建了不同插入長度的測序文庫進(jìn)行了大量測序，于2015年首次公布了白紋伊蚊佛山株基因組，版本號為AaloF1，基因組大小約為1.923 Gb，包括154 782個 scaffolds (Chenetal., 2015)。

已發(fā)布的幾種常見媒介蚊蟲基因組基本數(shù)據(jù)歸納于表1中。

表1 常見媒介蚊蟲基因組的基本數(shù)據(jù)Table 1 The basic information on the genome of major vector mosquitoes

不同蚊種的基因組大小差異巨大，這是由于重復(fù)序列是蚊蟲基因組的主要構(gòu)成，而且其所占比例與基因組大小呈正相關(guān)，比如岡比按蚊基因組中重復(fù)序列比例約為14%(Neafseyetal., 2015)，致倦庫蚊Cx.quinquefasciatus重復(fù)序列比例約為29%(Arensburgeretal., 2010)，埃及伊蚊重復(fù)序列比例約為65%(Matthewsetal., 2018)，白紋伊蚊基因組中重復(fù)序列比例約為68%(Chenetal., 2015)。這些基因組中大量的重復(fù)序列主要包括多基因家族(multigene family)、微衛(wèi)星(microsatellite)、小衛(wèi)星(minisatellite)、核糖體DNA(ribosomal DNA, rDNA)和轉(zhuǎn)座子(transposable element, TE)。

(1)微衛(wèi)星：是指基因組中由短的重復(fù)單元(一般為1～6個堿基)組成的DNA串聯(lián)重復(fù)序列，位于著絲粒和端粒區(qū)，反映位點特異性，具有高度多態(tài)性，在按蚊亞科中是很好的遺傳標(biāo)志(Fieldetal., 1999)，但在庫蚊亞科中的應(yīng)用有限(Bahnck and Fonseca, 2006)。

(2)核糖體DNA：rDNA由外轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(external transcribed spacer, ETS)、18S RNA基因、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1(internal transcribed spacer, ITS1)、5.8S RNA基因、ITS2、28S RNA基因，以及基因間非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(intergenic nontranscribed spacer, IGS)組成。ITS和IGS具有明顯的種間和種內(nèi)多態(tài)性，是重要的分類鑒定標(biāo)志(Waltonetal., 1999)。大多數(shù)庫蚊屬rDNA位于1號染色體；伊蚊、吸蚊屬位于2號染色體(Timoshevskiyetal., 2012)；阿蚊屬和竹生杵蚊Tripteroidesbambusa位于3號染色體(Kumar and RAI, 1990)；大多數(shù)按蚊屬rDNA位于X染色體，四環(huán)按蚊An.quadriannulatus、米拉按蚊An.melas、純凈按蚊An.merus、四斑按蚊An.quadrimaculata位于X和Y染色體(Collins and Paskewitz, 1996)；而三列騷擾蚊OchlerotatustriseriatusrDNA位于1號和3號染色體上(Grahametal., 2004)。

(3)轉(zhuǎn)座子(TE)：是中等重復(fù)DNA序列，具有能夠在基因組中移動并自身復(fù)制的功能。共有兩種類型：一類是反轉(zhuǎn)座子(retrotransposons)，通過RNA介導(dǎo)的反向轉(zhuǎn)錄而實現(xiàn)轉(zhuǎn)座；另一類直接從DNA到DNA實現(xiàn)轉(zhuǎn)座。在多種蚊基因組中已經(jīng)鑒定了大量的轉(zhuǎn)座子，相關(guān)具體內(nèi)容可以搜索并查詢TEfam數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站(https://tefam.biochem.vt.edu)(Diaoetal., 2011)。

1.2.2比較基因組

通過比較蚊與果蠅或不同蚊種之間基因組組成結(jié)構(gòu)，有助于發(fā)現(xiàn)物種特有的基因、研究蚊蟲性別決定機(jī)制、鑒定殺蟲劑抗性突變位點、分析不同蚊蟲傳播疾病的能力(即媒介能量)及了解蚊發(fā)育生物學(xué)和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。

岡比按蚊、致倦庫蚊、埃及伊蚊和白紋伊蚊分別屬于兩類不同蚊亞科，它們所攜帶傳播的病原種類和媒介能量均有顯著差異，生活習(xí)性也不盡相同。比較基因組學(xué)分析將有助于了解蚊蟲在這些生物學(xué)特性方面的區(qū)別、理解蚊媒病原體感染機(jī)制，這對尋找阻斷疾病傳播的途徑大有裨益。例如，不同蚊種對血液的不同偏好，在選擇宿主時的行為差異，傳播特定病原體時的個體能力差別，有些蚊在清晨、傍晚吸食人血，有些蚊多在夜間活動等。比較埃及伊蚊與岡比按蚊的基因組有諸多相似之處，但在基因組整體規(guī)模、基因密度及基因家族的構(gòu)成等方面有所差別。其中，岡比按蚊的氣味結(jié)合蛋白、細(xì)胞色素P450以及表皮相關(guān)的基因數(shù)量和種類多于埃及伊蚊，從基因組水平上顯示了這兩種蚊的生物學(xué)性狀差別(Seversonetal., 2004; Manoharanetal., 2013)。

致倦庫蚊基因組中約有18 965個編碼蛋白基因，比埃及伊蚊多29%，比岡比按蚊多45%。與兩種蚊相比，致倦庫蚊的基因家族數(shù)量明顯較多，包括與嗅覺和味覺受體、唾液腺和免疫系統(tǒng)功能等有關(guān)的基因。此外，致倦庫蚊與免疫反應(yīng)相關(guān)的基因大約有500個，與伊蚊相似，但明顯少于岡比按蚊和黑腹果蠅(Arensburgeretal., 2010)。致倦庫蚊是多種腦炎病毒及淋巴絲蟲的媒介，其復(fù)雜的基因結(jié)構(gòu)有可能提高了其向人類和鳥類傳播病毒的能力；也有些基因可能與對不利或外來有害物的適應(yīng)性有關(guān)，因為庫蚊的孳生地常常是污染嚴(yán)重的環(huán)境(Reddyetal., 2012)。

通過提取和比對不同蚊的上千個單拷貝同源基因并擬合模型、構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，發(fā)現(xiàn)埃及伊蚊與白紋伊蚊大約在7 140萬年前分化，伊蚊屬與庫蚊屬大約在1.79億年前分化，按蚊亞科與庫蚊亞科大約在2.18億年前分化，蚊科的共同祖先與同屬于雙翅目的果蠅大約在2.61億年前分化(Chenetal., 2015)，見圖1。

圖1 主要的媒介蚊蟲與黑腹果蠅的系統(tǒng)進(jìn)化圖Fig.1 The phylogeny tree of major vector mosquitoes and Drosophila melanogaster

通過比較雌、雄基因組Illumina測序數(shù)據(jù)，有學(xué)者發(fā)明了染色體商(chromosome quotient, CQ)的方法，篩選并鑒定了埃及伊蚊的性別決定基因Nix(Halletal., 2015)和斯氏按蚊An.stephensiY染色體基因Guy1(Criscioneetal., 2013; Criscioneetal., 2016)。國內(nèi)有學(xué)者使用類似的方法在白紋伊蚊中鑒定出雄性特異性基因Nix(埃及伊蚊Nix基因的直系同源基因)(Liuetal., 2020)。研究表明，如果從雄性個體中敲除雄性特異性基因，會導(dǎo)致雄性個體出現(xiàn)雌性化的性狀(Halletal., 2015; Liuetal., 2020)；如果將這些雄性決定相關(guān)的基因轉(zhuǎn)入雌性個體，會導(dǎo)致雌性個體表現(xiàn)雄性化性狀，或出現(xiàn)特異性、穩(wěn)定性的死亡(Aryanetal., 2019; Qietal., 2019)。這類研究為防控蚊媒疾病提供了新的思路(Adelman and Tu, 2016)。

近年來，隨著化學(xué)殺蟲劑的大量使用，蚊蟲對各類化學(xué)殺蟲劑的抗性也被廣泛報道。通過比較對不同種類化學(xué)殺蟲劑產(chǎn)生抗性的蚊蟲基因組和敏感的蚊蟲基因組發(fā)現(xiàn)，按蚊屬和庫蚊屬基因組中編碼乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase, AChE)的基因第119位密碼子由甘氨酸突變?yōu)榻z氨酸(G119S)，與蚊蟲對有機(jī)磷酸酯類(organophosphate)和氨基甲酸酯類(carbamate)殺蟲劑產(chǎn)生抗性相關(guān)(Djogbénouetal., 2010; Camerinoetal., 2015; Tmimietal., 2018)；伊蚊屬基因組中編碼電壓門鈉離子通道蛋白(voltage-gated sodium channel, VGSC)的基因第1534位密碼子由苯丙氨酸突變?yōu)榘腚装彼?F1534C)，與蚊蟲對擬除蟲菊酯類(pyrethroid)殺蟲劑產(chǎn)生抗性相關(guān)(Chenetal., 2016; Xuetal., 2016)。如果同時存在第1 016位密碼子由纈氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?V1016I)或甘氨酸(V1016G)，則與蚊蟲對殺蟲劑DDT產(chǎn)生抗性相關(guān)(Alvarezetal., 2015; Sombiéetal., 2019)。

2 蚊蟲轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

轉(zhuǎn)錄組學(xué)(transcriptomics)是一種生理狀態(tài)下細(xì)胞所能轉(zhuǎn)錄出來的所有mRNA的總和，是研究特定生理狀態(tài)下機(jī)體表型和功能的重要手段。傳統(tǒng)上用于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得和分析的方法主要有基于雜交技術(shù)的芯片技術(shù)，包括cDNA芯片和寡聚核苷酸芯片，但目前使用最普遍的是轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(RNA-seq)?；贗llumina高通量測序平臺的轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)能夠在單核苷酸水平對任意物種的整體轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行檢測，在分析轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)和表達(dá)水平的同時，還能發(fā)現(xiàn)未知轉(zhuǎn)錄本和低豐度轉(zhuǎn)錄本，精確地識別可變剪切位點以及cSNP(編碼序列單核苷酸多態(tài)性)，提供最全面的轉(zhuǎn)錄組信息。

斯氏按蚊雄性個體具有X和Y染色體，雌性個體具有一對X染色體，因此雄性的X染色體基因只有一份拷貝，雌性的X染色體基因有兩份拷貝，但雌性X染色體基因和雄性X染色體基因的表達(dá)水平是相同的，這種現(xiàn)象被稱為劑量補償效應(yīng)(dosage compensation)(Jiangetal., 2015)。斯氏按蚊X染色體上有上千個編碼基因，利用高通量的轉(zhuǎn)錄組測序的方法可以高效、快速、精確地計算每個編碼基因的相對表達(dá)水平，有研究發(fā)現(xiàn)在親本斯氏按蚊常染色體中轉(zhuǎn)入并表達(dá)Y染色體基因Guy1會導(dǎo)致雌性子代全部死亡，通過比較雄性子代和雌性子代轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，證明了Y染色體基因Guy1是直接啟動劑量補償效應(yīng)的信號，異常表達(dá)Guy1基因使雌性X染色體基因表達(dá)水平被錯誤上調(diào)是導(dǎo)致雌性子代全部死亡的主要原因(Qietal., 2019)。

另外，轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析還常用于蚊蟲不同發(fā)育階段、不同器官和不同性別的差異表達(dá)基因研究，例如：有研究通過比較和分析白紋伊蚊在卵(egg)、幼蟲(larva)、蛹(pupa)、雄性成蚊和吸血前后雌性成蚊、感染登革病毒前后等不同生理狀態(tài)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選得到了與胚胎發(fā)育相關(guān)基因、與雌性成蚊吸血相關(guān)基因、蚊蟲感染登革病毒后免疫相關(guān)基因等(Poelchauetal., 2013; Grigorakietal., 2015; Esquiveletal., 2016)；還有研究通過比較埃及伊蚊的頭(head)、觸角(antenna)、觸須(palp)、吻突(proboscis)、喙(rostrum)、腿(leg)、腹節(jié)(abdomere)和卵巢(ovary)等器官組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，可以得到多種基因的空間表達(dá)譜，包括編碼氣味分子受體(odorant receptor)、親離子型受體(ionotropic receptor, IR)和味覺受體(gustatory receptor, GR)的基因，這些基因被認(rèn)為與蚊蟲搜尋宿主密切相關(guān)(Priceetal., 2011; Alfonso-Parraetal., 2016; Matthewsetal., 2016)。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)的技術(shù)手段是深入研究蚊蟲的分子生物學(xué)相關(guān)領(lǐng)域的強大工具，提供了精確的數(shù)字化信號、高效的檢測通量和廣泛的檢測范圍，適用于綜合測量和計算蚊蟲基因相對表達(dá)水平，有助于研究者了解蚊蟲在不同生理狀態(tài)下的整體轉(zhuǎn)錄活動。

3 蚊蟲小RNA組學(xué)研究

小RNA(small RNAs)主要指長度在18～30 nt的一類非編碼RNA(ncRNA)。在真核生物中，具有基因表達(dá)調(diào)控功能的小RNA主要有微小RNA(microRNA, miRNA)、內(nèi)源小干擾RNA(endo-siRNAs)和piwi干擾RNA(piRNA)。miRNA和endo-siRNA長度主要集中在20～24 nt，piRNA長度集中在26～31 nt。miRNA在動植物和微生物中都普遍存在，據(jù)估計一個物種中約1/3的基因會受到miRNA的調(diào)控，大量的實驗也表明miRNA參與了諸多生命過程的調(diào)控，例如細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、組織器官的發(fā)生、營養(yǎng)代謝、信號途徑以及對外界生物的、非生物環(huán)境的反應(yīng)。piRNA目前主要在動物的生殖系干細(xì)胞、果蠅的卵巢體細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)(Klattenhoff and Theurkauf, 2008; Lauetal., 2009)，其主要功能是參與轉(zhuǎn)座子的沉默。以往用于尋找小RNA的方法主要有實驗克隆法和計算機(jī)預(yù)測法。實驗克隆法可以直接用于鑒定新的小RNA，是初期發(fā)掘小RNA的常用方法，不足之處是實驗周期較長，對低表達(dá)的小RNA的發(fā)現(xiàn)能力十分有限；計算機(jī)預(yù)測法多是針對某一已知的小RNA特征設(shè)計算法，從全基因組或EST數(shù)據(jù)庫中快速發(fā)掘大量潛在的小RNA，一定程度上彌補了克隆法的缺點，然而，預(yù)測的小RNA最終還需要實驗證明，而且計算機(jī)預(yù)測法對新類型小RNA的發(fā)掘能力十分有限。隨著第二代高通量測序技術(shù)的問世，小RNA測序(small RNA-Seq)技術(shù)開始逐漸取代原始的小RNA發(fā)掘法，該技術(shù)具有速度快、成本低、覆蓋度深等多方面的優(yōu)點，對鑒定與發(fā)現(xiàn)生命體內(nèi)的小分子RNA及其功能與機(jī)理研究具有重要作用。

目前為止，僅岡比按蚊、斯氏按蚊、埃及伊蚊、致倦庫蚊和白紋伊蚊有miRNA的鑒定報道(Winteretal., 2007; Mead and Tu, 2008; Lietal., 2009; Thirugnanasambanthametal., 2013; Biryukovaetal., 2014; Liuetal., 2015)。miRNA功能分析表明，miRNA對蚊蟲的卵巢發(fā)育和吸血后的血液消化具有調(diào)節(jié)作用(Bryantetal., 2010; Lucasetal., 2015)。另外，病毒感染可以對宿主細(xì)胞miRNA的表達(dá)水平產(chǎn)生巨大影響，這可能與宿主抗病毒機(jī)制及病毒入侵后改變細(xì)胞內(nèi)環(huán)境有關(guān)，雌蚊中miRNA的表達(dá)模式會隨著病原體的感染而發(fā)生變化(Hussainetal., 2013; Zhouetal., 2014b)。國外有學(xué)者對登革病毒(DENV)編碼的miRNA或病毒小RNA(vsRNA)的進(jìn)行了功能研究，他們發(fā)現(xiàn)6個vsRNA能通過作用于病毒基因組RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)中的5′和3′ UTR區(qū)，顯著增加病毒復(fù)制(Hussain and Asgari, 2014)。中腸屏障是蚊蟲防止病原體入侵的一道重要屏障，有研究發(fā)現(xiàn)miR-1174僅在伊蚊和按蚊的中腸中表達(dá)，且雌蚊吸血后其表達(dá)量明顯上調(diào)；而當(dāng)miR-1174表達(dá)下調(diào)后，蚊蟲吸血率明顯降低，壽命明顯縮短(Liuetal., 2014)。

國內(nèi)有研究對白紋伊蚊不同發(fā)育時期(卵、幼蟲、蛹、雄蚊、雌蚊、吸血后雌蚊)的小RNA進(jìn)行了深度測序分析。結(jié)果在白紋伊蚊中篩選出119條已知的miRNA基因，確定了15條新的miRNA基因，其中11條是白紋伊蚊特異的，并且許多miRNA僅在特定的發(fā)育時期表達(dá)：經(jīng)過實驗驗證，miR-286、miR-2492和miR-1891分別在白紋伊蚊的卵、幼蟲和成蟲期特異高效表達(dá)，敲低或敲除這些miRNA會對蚊蟲的生長發(fā)育造成顯著影響(Guetal., 2013; Liuetal., 2015)。這些研究為新型生物殺蟲劑的研發(fā)提供了靶標(biāo)。另外還有研究對感染登革病毒前后白紋伊蚊的細(xì)胞和成蟲的小RNA進(jìn)行了深度測序分析，結(jié)果在感染登革病毒的白紋伊蚊中找到了10條表達(dá)上調(diào)的miRNA和11條表達(dá)下調(diào)的miRNA(Skalskyetal., 2010)。通過對這些差顯表達(dá)miRNA的功能分析發(fā)現(xiàn)，miR-252通過與E蛋白3′ UTR區(qū)域的結(jié)合，對登革病毒的復(fù)制起到抑制作用(Yanetal., 2014)；而miR-281則通過與E蛋白5′ UTR區(qū)域的結(jié)合，對登革病毒的復(fù)制具有促進(jìn)作用。這些研究為抗登革病毒藥物的設(shè)計和研發(fā)提供了線索和方向(Zhouetal., 2014b)。

piRNA來源于轉(zhuǎn)座子、基因間隔區(qū)和一些編碼蛋白質(zhì)基因的3′ UTR區(qū)，對維持基因的完整性和穩(wěn)定性有一定作用，最近還有研究證明piRNA在抗病毒免疫中也有較大作用：對蚊蟲細(xì)胞感染蟲媒病毒可以引發(fā)piRNA通路，而敲除piRNA基因會使病毒滴度增加(Lucasetal., 2013; Schnettleretal., 2013)。多個24～30 nt與piwi相互作用的RNA基因組簇可以比對到轉(zhuǎn)座子和蛋白質(zhì)編碼基因的3′ UTR區(qū)，很多轉(zhuǎn)座子和一些內(nèi)源性基因的3′ UTR區(qū)會產(chǎn)生大量具有piRNA樣特征、長度為29 nt的小RNA峰(Castellanoetal., 2015)。另有研究通過對比缺失dicer-2基因的蚊細(xì)胞系和野生型蚊細(xì)胞系發(fā)現(xiàn)，病毒產(chǎn)生的piRNA樣小RNA可以在病毒產(chǎn)生siRNA的過程中調(diào)節(jié)病毒感染的發(fā)生，這可能是一種蚊蟲抗病毒感染的途徑(Morazzanietal., 2012)。