基于TGF-β1/p38MAPK通路探討益氣升清方對糖尿病大鼠腎組織的影響

江丹 汪何 姚楠

摘要 目的：探討益氣升清方對糖尿病大鼠腎組織TGF-β1/p38MAPK通路的影響。方法：SPF級大鼠60只，正常組10只，其余腹腔注射STZ制備DM模型。成模后隨機分為模型組（等量蒸餾水）、厄貝沙坦組[27 mg/（kg·d）]、中藥低劑量組[3.465 g/（kg·d）]、中藥中劑量組[6.93 g/（kg·d）]、中藥高劑量組[13.86 g/（kg·d）]，每組10只，給藥8周，檢測血糖、Scr、BUN，觀察腎組織的病理，用熒光定量PCR和免疫組化法檢測TGF-β1、p38MAPK、FN mRNA和蛋白的表達。結(jié)果：造模后各組血糖較正常組有顯著性升高（P<0.01），但組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。模型組大鼠血清BUN、Scr顯著增高（P<0.01），腎組織有大量TGF-β1、p38MAPK、FN mRNA及蛋白表達（P<0.01）;與模型組比較，各觀察組病理損害明顯減輕，血清BUN、Scr明顯降低（P<0.01），TGF-β1、p38MAPK、FN mRNA及蛋白表達明顯減少（P<0.01），厄貝沙坦組、中藥中、高劑量組優(yōu)于中藥低劑量組（P<0.01）。結(jié)論：糖尿病大鼠TGF-β1/p38MAPK通路的激活導(dǎo)致腎間質(zhì)病變，益氣升清方可減少TGF-β1、p38MAPK的表達，從而減少FN的沉積，起到保護腎臟的作用。

關(guān)鍵詞 益氣升清方;糖尿病腎病;轉(zhuǎn)化生長因子β/絲裂原活化蛋白激酶p38通路;纖維連接蛋白

Abstract Objective：To explore the effect of Yiqi Shengqing Fomula on TGF-β1/p38MAPK pathway in kidney tissue of diabetic rats. Methods：There were 60 SPF rats， among which 10 were in the normal group， and the rest were intraperitoneally injected with STZ to prepare DM models. After modeling， they were randomly divided into model group （equivalent distilled water）， irbesartan group [27 mg/（kg·d）]， low-dose Chinese medicine group [3.465 g/（kg·d）]， middle-dose Chinese medicine group [6.93 g/（kg·d）]， high-dose Chinese medicine group [13.86 g/（kg·d）]， 10 rats in each group. After 8 weeks of administration， blood glucose， Scr， BUN were detected， renal pathology was observed， quantitative fluorescence PCR and immunohistochemistry were used to detect the expression of TGF-β1， p38MAPK， FN mRNA and protein. Results：After modeling， the blood glucose of each group was significantly higher than that of the normal group （P<0.01）， but there was no significant difference between the groups （P>0.05）. The serum BUN and Scr of rats in the model group were significantly increased （P<0.01）， and the kidney tissue had a large amount of TGF-β1， p38MAPK， FN mRNA and protein expression （P<0.01）; compared with the model group， the pathological damage of each treatment group was significantly reduced， Serum BUN and Scr were significantly reduced （P<0.01）， TGF-β1， p38MAPK， FN mRNA and protein expression were significantly reduced （P<0.01）， irbesartan group， middle and high-dose Chinese medicine group were better than low-dose Chinese medicine group （P<0.01）. Conclusion：The activation of TGF-β1/p38MAPK pathway in diabetic rats leads to renal interstitial lesion. Yiqi Shengqing Fomula can reduce the expression of TGF-β1 and p38MAPK， thereby reducing the deposition of FN and protecting the kidneys.

Keywords Yiqi Shengqing Fomula; Diabetic nephropathy; TGF-β1/p38MAPK signaling pathway; FN

中圖分類號：R242;R285.5 文獻標識碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.16.006

糖尿病腎?。―iabetes Nephropathy，DN）是糖尿病嚴重的并發(fā)癥，近年來研究發(fā)現(xiàn)盡管DN初期主要表現(xiàn)為腎小球病變所致的蛋白尿，但腎小管間質(zhì)病變才是DN進行性發(fā)展過程中的始動因素，且比腎小球病變更能反映慢性腎功能衰竭的進展速率及預(yù)后[1]。轉(zhuǎn)化生長因子β（Transform Growth Factor-β1，TGF-β1）/絲裂原活化蛋白激酶p38（p38 Mitogen-activated Protein Kinase，p38MAPK）是腎臟纖維化過程中的重要信號通路。TGF-β1作為上游因子激活p38MAPK信號通路，MAPK活化增多與TGF-β1相互作用影響纖維連接蛋白（Fibro Nectin，F(xiàn)N）等細胞外基質(zhì)（Extracellular Matrix，ECM）的沉積;同時，活化的p38MAPK信號通路會誘導(dǎo)反向產(chǎn)物TGF-β1生成增多。所以阻斷TGF-β1/p38MAPK信號通路對延緩DN病程進展具有重要意義[2]。

DN的中醫(yī)病機目前認為在腎，但發(fā)病之根本在脾，又因患病日久易夾痰瘀，故本觀察組汪何教授提出早期DN主要病機為脾氣虛弱、清氣下陷，夾痰瘀。治法為健脾益氣、升清通絡(luò)，自擬方益氣升清方，前期大量臨床觀察已證實該方降低早期微量白蛋白、尿蛋白效果顯著[3]。本研究旨在通過TGF-β1/p38MAPK通絡(luò)探討益氣升清方對糖尿病大鼠腎的保護作用并探討其機制，為DN的防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級SD大鼠60只，雌雄各半，體質(zhì)量（200±20）g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，合格證號：44007200027779。飼養(yǎng)于廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院SPF級動物實驗室[許可證號：SYXK（粵）2015-0059]，實驗環(huán)境通風(fēng)良好，溫度21～24 ℃，濕度50% ～70%，12 h光照周期，自由攝水。實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。本實驗經(jīng)過廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院）實驗動物倫理委員會審核通過（倫理審批號：048460）

1.1.2 藥物 高糖高脂飼料（廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，貨號：44200300009327）;鏈脲佐菌素（Streptozocin STZ，Sigma公司，貨號：S0130）;厄貝沙坦片[賽諾菲（杭州）制藥有限公司，國藥準字H20040494];自擬益氣升清方湯藥（由黃芪、紅參、柴胡、葛根、丹參等飲片組成，按照動物實驗中藥制作標準煎煮濃縮而成），均以蒸餾水按比例配置成所需濃度，4 ℃冰箱保存。

1.1.3 試劑與儀器 實驗試劑：葡萄糖試劑（南京建成生物工程研究所，貨號：A031-1），Scr試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號：C011-1），BUN試劑（南京建成生物工程研究所，貨號：C013-2）。一抗兔抗鼠p38MAPKRabbit ab試劑（Cell Signaling Technology，美國，貨號：9212S），一抗兔抗鼠Anti-Fibronectin antibody[艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，貨號：ab2413]，一抗兔抗鼠Anti-TGF beta 1 antibody[艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司，貨號：ab92486]。二抗免疫組化試劑UItraSensitive S-P超敏試劑盒（鼠/兔）（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，貨號：40398a）。DAB顯色液（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，貨號：DAB-0031）;基因引物（上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成）。

實驗儀器：722光柵分光光度計（上海安亭科學(xué)儀器廠，型號：722型），小型高速離心機（Eppendorf公司，德國，型號：5424型），切片機（萊卡公司，德國，型號：LEICA RM2O15型），數(shù)碼生物顯微鏡（重慶奧體光學(xué)顯微鏡有限公司，型號：BK-DM500型），MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析管理系統(tǒng)（北京航空航天工業(yè)大學(xué)），超級純水儀（默克密理博有限公司，美國，型號：Milli Q Plus型），核酸蛋白測定儀[伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司，美國，SmartSpec plus型]，熒光定量PCR儀（Bio-Rad公司，美國，IQTM5型）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 按隨機數(shù)字表取10只大鼠作為正常組，給予普通飼料。其余50只大鼠高糖高脂飼料喂養(yǎng)，禁食不禁水12 h，單次腹腔注射STZ 35 mg/kg，72 h后尾尖采血，血糖≥16.7 mmol/L為造模成功。正常組10只大鼠腹腔注射相應(yīng)容量枸椽酸緩沖液。將造模成功的糖尿病大鼠隨機分為5組：模型組、厄貝沙坦組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組，每組10只，高糖高脂飼料喂養(yǎng)。

1.2.2 給藥方法 中藥低、中、高劑量組給藥量分別為3.465 g/（kg·d）（1/2臨床劑量）、6.93 g/（kg·d）（臨床等效劑量）、13.86 g/（kg·d）（2倍臨床劑量）;厄貝沙坦組用27 mg/（kg·d）劑量灌胃;模型組及正常組給予等劑量雙蒸水灌胃。1次/d，連續(xù)8周。

1.2.3 檢測指標與方法 處死大鼠，將右側(cè)腎去包膜保存于10%中性甲醛固定液中，常規(guī)石蠟包埋，切片;另一側(cè)腎臟液氮冷凍，-80 ℃冰箱保存。實驗過程中模型組、中藥低劑量組分別死亡1只大鼠，實驗結(jié)束大鼠共58只。造模成型后尾尖采血測葡萄糖，8周實驗結(jié)束前主動脈采血測葡萄糖、肌酐（Serum Creatinine，Scr）、尿素氮（Blood Urea Nitrogen，BUN）。熒光定量PCR法測定TGF-β1、P38MAPK、FN基因表達量。引物序列：TGF-β1，F(xiàn)：GGAGACGGAATACAG，R：ATGAGGAGCAGGAA，152bp;p38MAPK，F(xiàn)：CTCGCTGTGAATGA，R：TGTCTGGTTGTAGTG，144 bp;FN，F(xiàn)：GGCAGTAGCACAGA，R：TCCACAGCATAGATAGT，101 bp。應(yīng)用RNAprep pure組織總RNA提取試劑盒提取總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄說明書合成cDNA，由PCR反應(yīng)曲線得到Ct值，計算相對定量結(jié)果。

取固定后的石蠟切片，HE染色;同時用免疫組化試劑盒檢測腎組織TGF-β1、p38MAPK、FN蛋白表達。用MIAS醫(yī)學(xué)圖像分析管理系統(tǒng)進行圖像采集，讀片時每張片子取5個區(qū)域拍照，應(yīng)用IPP 6.0病理圖像分析軟件隨機測定免疫陽性產(chǎn)物的光密度值（OD值），然后作為該樣本的OD值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)值采用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用one-way ANOVA檢驗，組間比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

造模后各組血糖升高與正常組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），但造模后各組之間血糖比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），且治療8周后各組血糖變化比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），表明造模后各組大鼠一直處于高血糖狀態(tài)，模型成功。與模型組比較，厄貝沙坦組，中藥低、中、高劑量組Scr、BUN均有下降，且比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），厄貝沙坦組、中藥中、高劑量組BUN下降優(yōu)于中藥低劑量組（P<0.01）。結(jié)果見表1。

模型組大鼠腎組織TGF-β1、p38MAPK和FN基因表達量與正常組比較顯著增多（P<0.01）。與模型組比較，厄貝沙坦組，中藥低、中、高劑量組大鼠腎組織TGF-β1、p38MAPK、FN基因表達量均顯著減少（P<0.01）。與厄貝沙坦組比較，中藥中、高劑量組TGF-β1、FN基因表達量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），中藥低劑量組TGF-β1、FN基因表達量多于厄貝沙坦組（P<0.01）;中藥低、中劑量組p38MAPK基因表達量多于厄貝沙坦組（P<0.01），中藥高劑量組p38MAPK基因表達量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見表2。

光鏡下HE染色結(jié)果顯示：正常組腎單位飽滿無間隙，腎小球內(nèi)散在少部分紅細胞，腎小管細胞豐富，排列規(guī)則。模型組腎小球分葉狀，體積縮小，部分腎小球上皮細胞增生，囊腔間隙變大，大量紅細胞沉積;腎小管空泡樣變，部分管壁變薄，管腔變大。厄貝沙坦組腎小球內(nèi)紅細胞數(shù)目減少，腎小球管腔變化不明顯。中藥低劑量組腎小球囊腔間隙稍增大;腎小管擴張，空泡樣變;髓質(zhì)間質(zhì)有部分充血。中藥中劑量組腎小球內(nèi)紅細胞數(shù)目減少，囊腔間隙稍增大，無分葉狀改變;腎小管空泡樣變較少，有散在紅細胞。中藥高劑量組較中劑量組腎小管空泡樣變更少。結(jié)果見圖1。

免疫組化結(jié)果顯示，正常組大鼠腎組織TGF-β1、FN蛋白在部分腎小球、腎小管有少量表達（棕黃色顆粒，以下同）;p38MAPK在部分腎小管有少量表達。模型組大鼠腎組織TGF-β1、p38MAPK和FN較正常組明顯增多，以腎小管表達為主，腎小球也有明顯表達。與模型組比較，厄貝沙坦組，中藥中、高劑量組大鼠腎小管TGF-β1、p38MAPK和FN蛋白表達量明顯減少，且減少程度相當;中藥低劑量組大鼠TGF-β1、p38MAPK和FN蛋白表達也有一定程度減少。結(jié)果見圖2。

各組平均光密度值結(jié)果如下：模型組TGF-β1、p38MAPK和FN表達量均較正常組顯著增多（P<0.01）。與模型組比較，中藥低劑量組TGF-β1、p38MAPK表達量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與模型組比較，厄貝沙坦組和中藥中、高劑量組TGF-β1表達量均顯著減少（P<0.01）;中藥中劑量組p38MAPK表達量達略高于厄貝沙坦組、中藥高劑量組（P<0.01），但3組間TGF-β1表達量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與模型組比較，厄貝沙坦組，中藥低、中、高劑量組FN表達量均顯著減少（P<0.01）;中藥低劑量組FN表達量高于厄貝沙坦組（P<0.01）;中藥中、高劑量組FN表達量與厄貝沙坦組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)果見表3。

3 討論

益氣升清方是廣東省名中醫(yī)汪何教授的臨床經(jīng)驗方，針對早期DN多無癥狀，僅有倦怠乏力，小便夾雜泡沫，或便溏，舌淡苔薄，脈象軟的癥狀。目前多數(shù)學(xué)者主張DN的主要病機是脾腎虧虛為本，血瘀所致微型癥瘕為標[4]。汪何教授認為早期DN的主要病機是脾氣虛弱、清氣下陷，兼夾痰瘀，故提出健脾益氣、升清通絡(luò)為治法。以黃芪為君，一可補氣健脾以治氣虛之本，二可升提下陷陽氣，以求濁降清升，水谷精氣生化有源;葛根為臣藥，具有益氣生津之效;柴胡、丹參為佐，柴胡佐助升舉清陽，丹參有活血化瘀之力;紅參為使，旨在糾正氣虛，補太陰之生氣，使“陽得陰助而生化無窮”。組方既切合早期DN的主要病機，又可照顧兼夾癥，達到標本兼治目的[5]。團隊前期大鼠實驗研究發(fā)現(xiàn)該方可以抑制DN大鼠腎組織Notch1、Jagged1的高表達，減少TGF-β1的表達，從而減少大鼠24 h尿微量白蛋白排泄，起到保護腎臟的作用[6]。

DN病理改變傳統(tǒng)被認為是腎小球疾病，早期主要表現(xiàn)為腎小球和腎小管的肥大，基本病理改變最終導(dǎo)致腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化。因此，腎小管間質(zhì)纖維化也是糖尿病患者不可逆性的腎臟改變。TGF-β1是臨床慢性腎病進展的重要生物學(xué)標志物和治療靶標，參與DN的進程。研究表明TGF-β1/p38MAPK信號通路與腎臟炎性反應(yīng)及纖維化密切相關(guān)，由于表皮生長因子、胰島素樣生長因子促分裂與TGF-β的促分化作用對腎小管上皮細胞內(nèi)蛋白水解的抑制刺激反復(fù)存在，導(dǎo)致上皮細胞的過度、異常增殖與肥大，促進了腎間質(zhì)的炎性反應(yīng)與纖維化的形成。p38MAPK可以誘導(dǎo)炎性反應(yīng)細胞的活化和增殖。TGF-β1在信號通路的上游，通過激發(fā)p38MAPK而發(fā)揮其生物活性;同時，TGF-β1而作為下游p38MAPK信號通路的產(chǎn)物，合成增多可加劇腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化，加速慢性腎臟病進展[7]。FN有促進巨噬細胞的吞噬功能，促進細胞與纖維基質(zhì)間連接的生理作用。在DN時與Ⅳ型膠原一起作為ECM的主要成分而沉積增多。研究顯示短時間的高糖刺激亦能使腎小球系膜細胞p38MAPK信號通路激活，抑制p38MAPK信號通路可減少FN的表達[8]。

本實驗結(jié)果顯示，造模后各組血糖較正常組有顯著性升高（P<0.01），但造模后各組之間血糖比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），且治療8周后各組血糖變化比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），表明造模后各組大鼠一直處于高血糖狀態(tài)，模型成功。模型組大鼠血清BUN、Scr顯著增高（P<0.01）;腎組織有大量TGF-β1、p38MAPK、FN mRNA及蛋白表達（P<0.01），說明DN大鼠腎功能受損，腎小管間質(zhì)中陽性p38MAPK細胞數(shù)量反應(yīng)了間質(zhì)損傷程度。血管緊張素Ⅱ作為RAS主要的生物活性肽，不僅可以改變腎小球血流動力學(xué)，促進腎小球系膜細胞增生肥大，還可激活p38MAPK信號通路，能夠提高下游炎性反應(yīng)信號通路的激活水平，導(dǎo)致炎性反應(yīng)因子如腫瘤壞死因子α水平的上升，提高腎臟炎性反應(yīng)性損傷的程度，最終導(dǎo)致ECM過度沉積[9]。厄貝沙坦是RAS受體抑制劑，能夠阻斷RAS降低蛋白尿和抑制腎小球的硬化，延緩DN的進展，具有肯定的腎臟保護作用，因此作為陽性對照藥物。與模型組比較，各觀察組腎臟病理損害明顯減輕，血清BUN、Scr明顯降低（P<0.01），TGF-β1、p38MAPK、FN mRNA及蛋白表達明顯減少（P<0.01），厄貝沙坦組、中藥中、高劑量組優(yōu)于中藥低劑量組（P<0.01）。說明自擬方存在著一定的量效關(guān)系，中藥中劑量組（臨床等效劑量）具有明顯的療效，且中藥高劑量組優(yōu)于中劑量組。組方中藥現(xiàn)代藥理學(xué)結(jié)果顯示：黃芪中的黃芪多糖[10]、葛根中的葛根素[11]能抑制糖尿病大鼠腎組織TGF-β1mRNA的過度表達，丹參中的丹參酮可抑制成纖維細胞增殖和表型轉(zhuǎn)化，減少膠原沉積，抑制NO產(chǎn)生及釋放[12]，改善糖尿病大鼠早期腎臟病理改變。

綜上所述，益氣升清方能夠減輕腎臟損害，改善腎功能，其作用機制可能是通過調(diào)控TGF-β1/p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，減少FN的沉積，起到明顯的糖尿病腎臟保護及延緩病程進展的作用。

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（2019-11-24收稿 責(zé)任編輯：徐穎）