Diminazene對(duì)慢性腦低灌注大鼠腦內(nèi)炎癥反應(yīng)影響及機(jī)制研究

陸俊玲，薛曉，段瑞，張穎冬

血管性認(rèn)知障礙(VCI)是指所有血管因素導(dǎo)致的涵蓋從輕度認(rèn)知功能損害到癡呆，涉及至少一個(gè)認(rèn)知域受損的臨床綜合征[1-2]。研究顯示，VCI病理生理機(jī)制較為復(fù)雜，目前臨床上尚缺乏有效的干預(yù)藥物[3]。慢性腦低灌注(CCH)通常由高血壓、糖尿病和動(dòng)脈粥樣硬化等慢性血管和代謝疾病引起，可引發(fā)神經(jīng)炎癥，導(dǎo)致神經(jīng)退行性病變、認(rèn)知功能障礙等，是VCI重要發(fā)病機(jī)制假說之一[4]。研究證實(shí)，CCH大鼠模型可模擬VCI的病理過程[5]，同時(shí)炎癥反應(yīng)參與該過程[6]。腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)為體內(nèi)重要的體液調(diào)節(jié)系統(tǒng)，主要調(diào)控血壓和維持體內(nèi)水電解質(zhì)平衡[7]。近年研究證實(shí)，腦內(nèi)存在獨(dú)立的RAS，且對(duì)腦血管、認(rèn)知功能有重要作用[8]。有證據(jù)表明，RAS系統(tǒng)旁路ACE2-Ang-(1-7)-MasR軸可延緩VCI病理學(xué)進(jìn)程，降低炎癥反應(yīng)[9]。然而，由于Ang-(1-7)為一多肽，在體內(nèi)易降解，且難以通過血-腦屏障[10]，故難以實(shí)際應(yīng)用于臨床。三氮脒(DIZE)為常見的抗錐蟲藥，可有效對(duì)抗包括布魯氏菌和鏈球菌在內(nèi)的某些病原菌，又名貝尼爾(Berenil)或血蟲清。研究證實(shí)，持續(xù)使用DIZE可預(yù)防腦動(dòng)脈血栓、肺動(dòng)脈高壓、青光眼[11-12]。此外，研究發(fā)現(xiàn)DIZE為ACE2的激活劑，可激活RAS系統(tǒng)的ACE2-Ang-(1-7)-MasR軸導(dǎo)致八肽Ang Ⅱ裂解生成Ang-(1-7)[13]。本研究通過建立CCH大鼠模型[14]，探討DIZE對(duì)RAS旁路的激活作用及對(duì)慢性腦低灌注伴隨的炎癥反應(yīng)的治療作用，為臨床治療VCI提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 SPF級(jí)雄性SD大鼠32只，8周齡，體質(zhì)量250～300 g，由南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號(hào)為SCXK(蘇)2016-0005、SCXK(蘇)2016-0006]。室溫(23±2)℃、相對(duì)濕度50%～60%，12 h晝-12 h夜循環(huán)照明環(huán)境飼養(yǎng)，自由攝食、飲水。采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為假手術(shù)組、CCH組、CCH+低劑量DIZE組(低劑量DIZE組)及CCH+高劑量DIZE組(高劑量DIZE組)，每組8只。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備及給藥方法 采用永久結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈法制作CCH大鼠模型。大鼠術(shù)前12 h禁食不禁水，腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)進(jìn)行麻醉，取仰臥位，固定四肢及頭部后備皮并消毒，于頸部行正中切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈和迷走神經(jīng)。完成上述操作后對(duì)假手術(shù)組大鼠進(jìn)行逐層縫合；CCH組、低劑量DIZE組、高劑量DIZE組的大鼠用4號(hào)手術(shù)線于遠(yuǎn)心端永久結(jié)扎雙側(cè)頸總動(dòng)脈后逐層縫合。術(shù)后對(duì)所有大鼠腹腔注射青霉素(8萬單位/只)預(yù)防感染，待大鼠蘇醒后，放回籠具飼養(yǎng)。

建模1周后低劑量DIZE組[2 mg/(kg·d)]及高劑量DIZE組[10 mg/(kg·d)]腹腔注射DIZE(Sigma公司)，持續(xù)8周。給藥8周后每組取8只，腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)對(duì)大鼠進(jìn)行麻醉，使用0.9% NaCl溶液對(duì)大鼠進(jìn)行心臟灌注，斷頭取腦，取皮質(zhì)部分檢測(cè)ACE2活性、炎癥因子、Ang-(1-7)、Mas受體mRNA水平。

1.2.2 ACE2活性的檢測(cè) 通過比色試劑盒檢測(cè)ACE2活性的變化。取大鼠腦皮質(zhì)部分，放入離心管中，超聲勻漿，4 ℃離心機(jī)13 000 r/min離心10 min后，取上清液。使用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒在黑色的96孔板上行ACE2酶活性檢測(cè)，將ACE2裂解緩沖液、樣本蛋白和ACE2特異性熒光底物混勻后在酶標(biāo)儀上測(cè)熒光強(qiáng)度。激發(fā)熒光波長(zhǎng)330 nm，散射波長(zhǎng)390 nm，反應(yīng)溫度37 ℃連續(xù)檢測(cè)4 h[15]。

1.2.3 腦內(nèi)炎癥因子水平的檢測(cè) ELISA檢測(cè)大鼠腦組織IL-1β、IL-12、IL-6、TNF-α的變化。取大鼠皮質(zhì)部分，經(jīng)裂解、勻漿、離心后取部分清液后于-80 ℃冰箱保存直至下一次使用。采用ELISA法參照試劑盒說明利用酶標(biāo)儀檢測(cè)血清IL-1β、IL-12、IL-6、TNF-α(Invitrogen公司)水平，以空位孔為對(duì)照，450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)各孔的吸光度(OD值)。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，測(cè)量對(duì)應(yīng)的A450為縱坐標(biāo)，通過曲線連接不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的坐標(biāo)點(diǎn)繪制光滑曲線；將待測(cè)樣本吸光度測(cè)量值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到待測(cè)樣本濃度[16-18]。

1.2.4 Ang-(1-7)水平的檢測(cè) ELISA法檢測(cè)大鼠腦組織Ang-(1-7)的變化。取上一步驟中保存于-80 ℃的上清液，采用ELISA法參照試劑盒說明利用酶標(biāo)儀檢測(cè)Ang-(1-7)(RD公司)，水平以空位孔調(diào)零，450 nm波長(zhǎng)依序各孔的吸光度(OD值)。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，測(cè)量對(duì)應(yīng)的A450為縱坐標(biāo)，通過曲線連接不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)的坐標(biāo)點(diǎn)繪制光滑曲線。將待測(cè)樣本吸光度測(cè)量值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到待測(cè)樣本濃度[16-18]。

1.2.5 Mas受體(MasR)mRNA水平的檢測(cè) 采用PCR檢測(cè)MasR的變化。取大鼠腦皮質(zhì)部分，搗碎后加入1 ml Ttizol溶液，勻漿；加入氯仿0.2 ml，劇烈整蕩15 s，4 ℃離心機(jī)12 000 r/min離心15 min，棄上清液，加入75%乙醇洗沉淀，晾干。取4 μl總RNA行逆轉(zhuǎn)錄(美國(guó)ABI公司)，取2 μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行qRT-PCR(美國(guó)ABI公司，SYBR Green Mix)。擴(kuò)增程序步驟：90 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃進(jìn)行40循環(huán)3 s，60 ℃進(jìn)行30 s延伸[13]。MasR引物序列：上游GCT TGC CGA GTT TTG CTG AA，下游TGA GGG CTC CCT TCT GAC TT；以β-actin作為內(nèi)參，引物序列：上游GTG CTA TGT TGC TCT AGA CTT CG，下游ATG CCA CAG GAT TCC ATA CC。

2 結(jié) 果

2.1 DIZE對(duì)腦內(nèi)ACE2-Ang-(1-7)-MasR軸的影響

2.1.1 假手術(shù)組、CCH組、低劑量DIZE組及高劑量DIZE組ACE2活性的比較 見表1。與假手術(shù)組比較，CCH組ACE2水平明顯降低(64.0%)(P<0.05)。低劑量DIZE組ACE2表達(dá)為CCH組的5.0倍(P<0.05)，高劑量DIZE組為CCH組的6.7倍(P<0.05)。高劑量DIZE組ACE2水平顯著高于低劑量DIZE組(P<0.05)。

2.1.2 假手術(shù)組、CCH組、低劑量DIZE組及高劑量DIZE組Ang-(1-7)水平的比較 見表1。與假手術(shù)組比較，CCH組腦內(nèi)Ang-(1-7)水平顯著降低(75.5%)(P<0.05)。低劑量DIZE組Ang-(1-7)水平為CCH組的8.0倍(P<0.05)，高劑量DIZE組為CCH組的11.4倍(P<0.05)。高劑量DIZE組Ang-(1-7)水平顯著高于低劑量DIZE組(P<0.05)。

2.1.3 假手術(shù)組、CCH組、低劑量DIZE組及高劑量DIZE組MasR mRNA表達(dá)的比較 見表1。與假手術(shù)組比較，CCH組MasR mRNA顯著降低(49.5%)(P<0.05)。低劑量DIZE組MasR mRNA水平為CCH組的2.9倍(P<0.05)，高劑量DIZE組為CCH組的4.8倍(P<0.05)。高劑量DIZE組MasR mRNA表達(dá)顯著高于低劑量DIZE組(P<0.05)。

2.2 DIZE對(duì)腦內(nèi)炎癥因子的影響

表1 各組ACE2活性、Ang-(1-7)水平及MasRmRNA表達(dá)的比較(x±s,n=8)組別ACE2Ang-(1-7)(pg/mg)MasRmRNACCH組0.36±0.02?8.92±1.26?0.52±0.16?低劑量DIZE組1.81±0.24#71.09±16.92#1.51±0.15#高劑量DIZE組2.41±0.42#△101.86±32.14#△2.48±0.31#△假手術(shù)組1.00±0.1236.48±3.311.03±0.18 注:與假手術(shù)組比較?P<0.05;與CCH組比較#P<0.05;與低劑量組相比△P<0.05

2.2.1 假手術(shù)組、CCH組、低劑量DIZE組及高劑量DIZE組IL-1β水平的比較 見表2。與假手術(shù)組比較，CCH組IL-1β水平為假手術(shù)組5.2倍(P<0.05)。高劑量DIZE組IL-1β水平較CCH組明顯降低(66.7%)(P<0.05)。高劑量DIZE組IL-1β水平顯著低于低劑量DIZE組(P<0.05)。低劑量DIZE組與CCH組IL-1β水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2.2 假手術(shù)組、CCH組、低劑量DIZE組及高劑量DIZE組IL-12水平的比較 見表2。與假手術(shù)組比較，CCH 組IL-12水平為假手術(shù)組4.2倍(P<0.05)。低劑量DIZE組IL-12水平較CCH組降低(25.9%)(P<0.05)，高劑量DIZE組IL-12水平較CCH組明顯降低(32.8%)(P<0.05)。高劑量DIZE組與低劑量DIZE組IL-12水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2.3 假手術(shù)組、CCH組、低劑量DIZE組及高劑量DIZE組IL-6水平的比較 見表2。與假手術(shù)組比較，CCH組IL-6水平為假手術(shù)組6.4倍(P<0.05)。低劑量DIZE組IL-6水平較CCH組降低(37.2%)(P<0.05)，高劑量DIZE組IL-6水平較CCH組明顯降低(70.5%)(P<0.05)。高劑量DIZE組IL-12水平顯著低于低劑量DIZE組(P<0.05)。

2.2.4 假手術(shù)組、CCH組、低劑量DIZE組及高劑量DIZE組TNF-α水平的比較 見表2。與假手術(shù)組比較，CCH組TNF-α水平為假手術(shù)組2.8倍(P<0.05)。低劑量DIZE組TNF-α水平較CCH組明顯降低(31.1%)(P<0.05)，高劑量DIZE組TNF-α水平較CCH組明顯降低(61.4%)(P<0.05)。高劑量DIZE組TNF-α水平顯著低于低劑量DIZE組(P<0.05)。

表2 假手術(shù)組、CCH組、低劑量DIZE組及高劑量DIZE組IL-1β、IL-12、IL-6及TNF-α水平的比較(x±s,n=8)組別IL-1β(pg/mg)IL-12(pg/mg)IL-6(pg/mg)TNF-α(pg/mg)CCH組363.65±77.48?337.28±79.68?266.91±48.08?89.39±25.31?低劑量DIZE組315.93±67.01250.30±57.24#167.63±47.99#61.57±18.27#高劑量DIZE組120.91±35.32#△226.82±62.93#78.61±23.85#△34.47±8.03#△假手術(shù)組70.04±22.41183.11±50.2241.53±7.8932.39±8.64 注:與假手術(shù)比較?P<0.05;與CCH組比較#P<0.05;與低劑量組比較△P<0.05

3 討 論

我國(guó)人口老齡化程度日益加重，腦血管病和癡呆患病率呈上升趨勢(shì)，因此防治VCI具有重要臨床意義。研究顯示，VCI病理生理機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚無有效干預(yù)藥物[3]。本課題組通過建立CCH大鼠模型發(fā)現(xiàn)，大鼠的大腦中ACE2和Ang-(1-7)水平明顯降低，炎癥因子顯著增多。Xie等[19]研究發(fā)現(xiàn)，CCH中炎癥因子增多可能與ACE2-Ang-(1-7)-MasR軸失調(diào)導(dǎo)致的抑制炎癥能力下降有關(guān)。故本課題組推測(cè)通過激活A(yù)CE2，調(diào)控其下游，增強(qiáng)MasR mRNA表達(dá)，可以增強(qiáng)該軸抗炎能力。

DIZE被認(rèn)為是ACE2內(nèi)源性激動(dòng)劑，可通過舒張血管、抗炎和激活A(yù)CE2等途徑保護(hù)心臟、神經(jīng)系統(tǒng)及緩解疼痛等[20-22]。近年來，越來越多的研究證實(shí)DIZE也有腦部保護(hù)功能[23-24]。Regenhardt等[23]發(fā)現(xiàn)，持續(xù)7 d向腦梗死模型大鼠腦室內(nèi)注入DIZE(5 mg/h)，可降低大鼠血壓及大腦梗死面積，同時(shí)MasR拮抗劑A779可阻斷該腦保護(hù)作用。Bennion等[24]通過研究證實(shí)，腹腔注射DIZE可減少腦梗死大鼠模型的梗死體積并改善神經(jīng)功能缺損，這種作用也可被A779減弱。本研究通過對(duì)大鼠腹腔注射高低兩種劑量的DIZE發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，CCH組腦組織內(nèi)炎癥因子IL-1β、IL-12、IL-6、TNF-α明顯升高；ACE2、MasR mRNA、Ang-(1-7)明顯降低，證實(shí)了慢性腦低灌注發(fā)生后可抑制ACE2-Ang-(1-7)-MasR軸，且導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加劇。與CCH組相比，注射低劑量DIZE及高劑量DIZE能夠使腦內(nèi)ACE2、MasR mRNA、Ang-(1-7)升高，炎癥因子IL-6、IL-12、TNF-α降低，且除IL-12外均呈劑量依賴性；僅高劑量DIZE能夠使炎癥因子IL-1β降低。因此猜測(cè)DIZE通過激動(dòng)ACE2活性，促進(jìn)AngⅡ轉(zhuǎn)變?yōu)锳ng-(1-7)，從而激活MasR介導(dǎo)的抑炎信號(hào)通路[25]。與國(guó)內(nèi)外研究比較，本研究首次發(fā)現(xiàn)DIZE能夠抑制慢性腦低灌注大鼠腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，但尚存在部分不足，如未在實(shí)驗(yàn)前后進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)估大鼠認(rèn)知功能變化，未檢測(cè)MDA反應(yīng)大鼠腦部脂質(zhì)氧化程度等。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，本研究將通過檢測(cè)大鼠認(rèn)知功能、建立細(xì)胞凋亡模型等，完善結(jié)論。

綜上所述，DIZE作為ACE2激動(dòng)劑能夠激活A(yù)CE2-Ang-(1-7)-MasR軸抑制CCH模型大鼠腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)。該結(jié)論為臨床中完善VCI患者治療方式提供了新的思路。