細(xì)胞器靶向光敏劑的研究進(jìn)展

李西鵬，張 濤

（華南師范大學(xué)生物光子學(xué)研究院，激光生命科學(xué)研究所教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510631）

光動(dòng)力治療（photodynamic therapy）是一種光激活的在臨床上非常有前景的癌癥治療方式[1-3]。在光動(dòng)力治療過(guò)程中，光敏劑在特定波長(zhǎng)的激光照射下被激活，生成活性很強(qiáng)的活性氧物種（reactive oxygen species，ROS），如單線態(tài)氧，其能與附近生物大分子發(fā)生氧化反應(yīng)產(chǎn)生細(xì)胞毒性，進(jìn)而殺傷腫瘤細(xì)胞[4-7]。然而，ROS 的半衰期很短（<40 ns），并且只能在生成部位附近起作用（<20 nm），這比整個(gè)細(xì)胞的尺寸小得多[8-11]。因此，將光敏劑遞送至對(duì)ROS敏感的細(xì)胞器將有望改善光動(dòng)力治療的效果。

細(xì)胞是生物體的基本功能單元，而細(xì)胞器則是細(xì)胞功能正常運(yùn)行不可缺失的部分。真核細(xì)胞的細(xì)胞器主要包括細(xì)胞核、線粒體、溶酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等。只有每種細(xì)胞器各司其職，協(xié)助細(xì)胞完成正常的生理功能，生命才能得以存在和延續(xù)。因此，細(xì)胞器被認(rèn)為是光動(dòng)力治療的重要靶標(biāo)。設(shè)計(jì)不同細(xì)胞器的靶向光敏劑能增強(qiáng)光敏劑在細(xì)胞器的聚集，有助于提高光動(dòng)力治療的療效，減少毒副作用。本文主要聚焦細(xì)胞器靶向光敏劑的實(shí)現(xiàn)策略的研究現(xiàn)狀，并希望為以后構(gòu)建新的靶向型光敏劑提供參考。

1 細(xì)胞核靶向光敏劑

眾所周知，細(xì)胞核是細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)儲(chǔ)存、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄的場(chǎng)所,在細(xì)胞的代謝、生長(zhǎng)和分化中起著重要的作用[12-13]。細(xì)胞核是高度分化的細(xì)胞器，具有雙層磷脂膜，核膜上的核孔復(fù)合體（nuclear pore complexes，NPCs）是物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核的唯一通道?，F(xiàn)階段細(xì)胞核靶向主要利用穿膜肽（transcriptional activator protein，TAT）和核定位序列（nuclear localization sequence，NLS）來(lái)實(shí)現(xiàn)。

1.1 TAT

Yu等[14]合成了1種基于上轉(zhuǎn)換納米粒子（upconversion nanoparticles，UCNPs）的細(xì)胞核靶向雙光敏劑 NaFY4:Yb,Er,Tm@TiO2-Chlorin e6-TAT（UCNPs@TiO2-Ce6-TAT）。UCNPs的激發(fā)光為980 nm，發(fā)射光為362 nm和655 nm，這2種波長(zhǎng)的發(fā)射光分別被 TiO2和二氫卟吩 e6（chlorin e6，Ce6）吸收并產(chǎn)生多種ROS。利用TAT將納米顆粒轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，使ROS在核內(nèi)積累。細(xì)胞核中大量ROS的積累會(huì)破壞DNA雙鏈導(dǎo)致細(xì)胞死亡（圖1）。

圖1 核靶向雙光敏劑UCNPs@TiO2-Ce6-TAT在980 nm近紅外激光激發(fā)下產(chǎn)生多種ROS并誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂的示意圖[14]Fig.1 Schematic illustration of the synthetic process of the nuclear targeted dual-photosensitizer UCNPs@TiO2-Ce6-TAT,multiple ROS generation under a single 980 nm NIR laser excitation and inducing DNA double strand breaks[14]

1.2 NLS

Cheng等[15]制備了自傳遞嵌合肽納米棒（self-delivery chimeric peptide nanorods，pnPNP），用于質(zhì)膜和核靶向的光敏劑傳遞。嵌合的肽[C16K(PpIX)PKK KRKVPEG8]由用于質(zhì)膜靶向的疏水烷基鏈(C16)、光敏劑原卟啉（protoporphyrin IX，PpIX）、核定位序列PKKKRKV和一個(gè)親水的聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）鏈組成。質(zhì)膜靶向pnPNP可直接誘導(dǎo)細(xì)胞壞死，增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性，從而改善細(xì)胞攝取。隨后，光誘導(dǎo)的內(nèi)源/溶酶體破壞，促進(jìn)了pnPNP的溶酶體逃逸。在NLS肽的參與下，具有正表面電荷自組裝的納米棒pnPNP能夠定位于細(xì)胞核。細(xì)胞核內(nèi)產(chǎn)生的ROS將對(duì)DNA鏈造成顯著的氧化損傷（圖 2）。

圖2 pnPNP用于質(zhì)膜和核靶向光動(dòng)力治療的原理圖[15]Fig.2 Schematic illustration of pnPNP for plasma membrane and nucleus targeted photodynamic therapy[15]

2 線粒體靶向光敏劑

線粒體作為至關(guān)重要的細(xì)胞器在細(xì)胞能量的產(chǎn)生和細(xì)胞的程序性死亡過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用[16-17]。因此，線粒體被認(rèn)為是光動(dòng)力治療腫瘤的重要靶標(biāo)，增強(qiáng)光敏劑在線粒體部位的聚集將有助于提高光動(dòng)力治療的療效。

目前，實(shí)現(xiàn)光敏劑靶向線粒體的策略主要有3種：一是離域親脂性陽(yáng)離子（delocalized lipophilic cation，DLC）靶向；二是線粒體靶向肽策略；三是構(gòu)建納米載體。其中三苯基膦（triphenylphosphine，TPP）是最典型的、應(yīng)用最廣泛的線粒體靶向配體，主要是因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，能與光敏劑末端連接且不破壞光敏劑。這里主要介紹基于TPP的2種納米載體負(fù)載光敏劑的策略。

2.1 有機(jī)線粒體靶向納米載體負(fù)載光敏劑

有機(jī)納米載體具有載運(yùn)效率高、體內(nèi)循環(huán)周期短、生物毒性小和載藥種類多等獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，已在線粒體靶向光動(dòng)力治療中被廣泛應(yīng)用。

Yue等[18]將TPP連在熱敏脂質(zhì)體上，并在脂質(zhì)體內(nèi)部裝載光敏劑IR-780和抗癌藥洛尼達(dá)明，構(gòu)建成線粒體靶向的熱敏型脂質(zhì)體（IR-780 and Lonidamine encapsulated mitochondria-targeting thermosensitive liposomes，IL-TTSL），用于靶向腫瘤線粒體光熱觸發(fā)的光熱-光動(dòng)力-化學(xué)治療。在近紅外（near infrared，NIR）激光的照射下，IR-780引起局部溫度升高從而誘導(dǎo)洛尼達(dá)明的釋放，可用于化學(xué)治療，且局部的高溫還可用于光熱治療。同時(shí)IR-780在腫瘤線粒體中產(chǎn)生大量的ROS，實(shí)現(xiàn)了最大化的光動(dòng)力治療（圖3）。

圖3 808 nm激光觸發(fā)線粒體靶向熱敏脂質(zhì)體IL-TTSL化療-光動(dòng)力和光熱聯(lián)合療法的示意圖[18]Fig.3 Schematic illustration of the mitochondria-targeting thermosensitive liposomes IL-TTSL for chemo-,photodynamic and photothermal combined therapy triggered by 808 nm laser[18]

Guan等[17]將TPP與聚集誘導(dǎo)發(fā)光（aggregation-induced emission，AIE）聚合物相連，同時(shí)將上轉(zhuǎn)換納米粒子負(fù)載在其內(nèi)部，構(gòu)建成UCNP@PAIE-TPP NPs，解決了AIE光敏劑只能被紫外或可見(jiàn)光激活的問(wèn)題（圖4）。在NIR激光的照射下，上轉(zhuǎn)換納米粒子發(fā)出上轉(zhuǎn)換熒光，并激活A(yù)IE聚合物在線粒體部位產(chǎn)生高水平的ROS。

圖4 pH響應(yīng)的UCNP@PAIE-TPP-PEG NP作為近紅外光觸發(fā)線粒體靶向光敏劑產(chǎn)生ROS用于光動(dòng)力治療的示意圖[19]Fig.4 Schematic diagram of pH responsive UCNP@PAIETPP-PEG NPs as the NIR triggered mitochondria targeting photosensitizer to generate ROS for photodynamic therapy[19]

Yang等[20]設(shè)計(jì)合成了一種多步響應(yīng)性智能納米粒子（CAT@S/Ce6-CTPP/DPEG），該納米粒子具有如下優(yōu)勢(shì)：1）對(duì)pH敏感，并且響應(yīng)pH后會(huì)變成帶正電的顆粒，能夠增強(qiáng)腫瘤的內(nèi)吞作用，增加納米粒子在腫瘤部位的滯留時(shí)間；2）在腫瘤微酸環(huán)境的作用下，TPP暴露出來(lái)，從而使得納米粒子靶向線粒體；3）過(guò)氧化氫酶催化過(guò)氧化氫產(chǎn)生氧氣，克服了腫瘤缺氧問(wèn)題，進(jìn)一步增強(qiáng)了光動(dòng)力治療的療效；4）其與程序性死亡配體 1（programmed deathligand 1，PD-L1）抗體結(jié)合，還能抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移（圖5）。

圖5 智能納米反應(yīng)器用于pH響應(yīng)性腫瘤歸巢、線粒體靶向和增強(qiáng)型光動(dòng)力免疫療法的示意圖[20]Fig.5 Schematic diagram of smart nanoreactors for pH-responsive tumor homing,mitochondria-targeting,and enhanced photodynamic-immunotherapy of cancer[20]

2.2 無(wú)機(jī)線粒體靶向納米載體負(fù)載光敏劑

無(wú)機(jī)納米載體通常具有適用于細(xì)胞遞送的通用特性，包括廣泛的可用性、豐富的功能、良好的生物相容性、靶向遞送的潛在能力和可控釋藥，表面還可進(jìn)行修飾擴(kuò)展其功能性?；谏鲜鰞?yōu)勢(shì)，無(wú)機(jī)納米載體在線粒體靶向光動(dòng)力治療領(lǐng)域受到了廣泛的關(guān)注。

Yu等[21]將TPP修飾到負(fù)載TiO2的上轉(zhuǎn)換納米粒子UCNPs表面，用以靶向線粒體，在NIR激光照射下進(jìn)行光動(dòng)力治療。在光動(dòng)力治療的研究中，UCNPs@TiO2-NH2組在光照條件下僅能殺死30%的癌細(xì)胞，而修飾了TPP的UCNPs@TiO2-NH2組的腫瘤細(xì)胞抑制率達(dá)到90%，光動(dòng)力治療效果顯著提升（圖 6）。

圖6 納米光敏劑（TPP錨定的UCNPs@TiO2納米顆粒）的結(jié)構(gòu)和ROS生成的示意圖[21]Fig.6 Schematic illustration of the structure of the nanophotosensitizer(TPP anchored UCNPs@TiO2nanoparticles)and ROS generation[21]

Yang 等[22]首先將聚多巴胺（polydopamine，PDA）負(fù)載到黑磷（black phosphorus，BP）上形成BP@PDA，然后將TPP和Ce6與BP@PDA相連，構(gòu)建成光療劑BP@PDA-Ce6&TPP NSs，用于線粒體靶向的光熱-光動(dòng)力治療（圖7）。

圖7 BP@PDA-Ce6＆TPP NS的制備和治療功能的示意圖[22]Fig.7 Schematic illustration of the preparation and therapeutic functions of BP@PDA-Ce6&TPP NSs[22]

3 溶酶體靶向光敏劑

溶酶體是一種動(dòng)態(tài)的、多態(tài)的、含水解酶的細(xì)胞器，具有接受和降解來(lái)自分泌、內(nèi)吞、自噬和吞噬膜轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的大分子的能力。溶酶體的功能取決于膜的完整性。溶酶體膜的受損（例如堿化或易位）會(huì)導(dǎo)致質(zhì)子和水解酶泄漏，從而引起細(xì)胞器功能障礙，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[23-25]。因此，設(shè)計(jì)靶向溶酶體的光敏劑，可以迅速引起溶酶體功能障礙。Li等[26]設(shè)計(jì)了一個(gè)雙碘取代的氟硼二吡咯（diiodo-substituted BODIPY，MBDP）（圖 8）作為光敏劑。試驗(yàn)表明，在激光照射下，溶酶體特異性靶向的MBDP會(huì)破壞溶酶體的完整性，最終引起癌細(xì)胞凋亡。

圖8 溶酶體靶向光敏劑MBDP的結(jié)構(gòu)和光動(dòng)力治療示意圖[26]Fig.8 Schematic diagram of the structure and photodynamic therapy of lysosomal targeting photosensitizer MBDP[26]

Niu等[27]設(shè)計(jì)了一種陽(yáng)離子二萘嵌苯探針（cationic perylene probe，PC4）（圖 9）。該探針具有極好的水溶解性、高化學(xué)穩(wěn)定性、光穩(wěn)定性以及高效的單線氧產(chǎn)生能力。PC4能特異性靶向溶酶體，3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]試驗(yàn)證明，PC4具有可忽略不計(jì)的暗毒性（IC50>500 mmol/L），并且在光照下，低劑量的PC4顯示出優(yōu)異的光毒性（IC50=2.8 mmol/L，4.2 J/cm2）。更重要的是，PC4在死細(xì)胞中從溶酶體向細(xì)胞核的移動(dòng)為監(jiān)測(cè)和評(píng)估治療效果提供了一個(gè)有效的方法。

Zhou等[28]制備了Ru-Pt雙金屬雙光子超分子配位化合物（supramolecular coordination complexes，SCCs）（圖10）。由6個(gè)基于Ru（II）的光敏劑和4個(gè)基于Pt（II）的受體構(gòu)建成1個(gè)單分子超集合體中的嵌段，通過(guò)協(xié)調(diào)驅(qū)動(dòng)自組裝形成八面體Ru-Pt，其具有深紅色發(fā)射、較大范圍的雙光子吸收和高效的ROS產(chǎn)生效率。形成的納米顆粒能選擇性在溶酶體中積累。在體試驗(yàn)證明，使用Ru-Pt雙金屬的雙光子光動(dòng)力治療具有顯著的抗腫瘤功效。

4 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向光敏劑

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）是真核細(xì)胞中最大的細(xì)胞器，在多種細(xì)胞內(nèi)代謝功能中起著復(fù)雜而關(guān)鍵的作用，包括生物合成、傳感和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，特別是在蛋白質(zhì)折疊和翻譯后修飾中。許多刺激物可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，通過(guò)未折疊蛋白反應(yīng)以及Ca2+信號(hào)機(jī)制導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[29-31]。

圖9 溶酶體靶向光敏劑PC4的結(jié)構(gòu)、光動(dòng)力治療和成像過(guò)程的示意圖[27]Fig.9 Schematic diagram of the structure of lysosomal targeting photosensitizer PC4,photodynamic therapy and imaging process[27]

圖10 溶酶體靶向光敏劑SCCs的結(jié)構(gòu)[28]Fig.10 Structure of lysosomal targeting photosensitizer SCCs[28]

Zhou等[32]報(bào)道了一種基于氟硼二吡咯的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向光敏劑（boron dipyrromethene，BODIPY）（圖 11）。在中間氫原子處引入2個(gè)鹵素原子，通過(guò)重原子效應(yīng)BODIPY可以產(chǎn)生單線態(tài)氧。在BODIPY核心的部分引入格列本脲能使光敏劑特異性靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，激光照射下能明顯引發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡。

圖11 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向光敏劑BODIPY的結(jié)構(gòu)和光動(dòng)力治療過(guò)程的示意圖[32]Fig.11 Schematic diagram of the structure and photodynamic therapy process of endoplasmic reticulum targeted photosensitizer BODIPY[32]

Zhao等[33]將ER靶向部分甲基磺酰胺、小分子共軛分子靶向藥物厄洛替尼（erlotinib，EB）以及硅酞菁[silicon(IV)phthalocyanine dichloride，Pc]共價(jià)連接，合成目標(biāo)化合物EB-ER-Pc（圖12）。該化合物可以選擇性地在表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）過(guò)表達(dá)的腫瘤細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)進(jìn)行光動(dòng)力治療。體外試驗(yàn)證明，EB-ER-Pc具有優(yōu)良的腫瘤靶向特異性以及出色的光動(dòng)力抗癌活性。

圖12 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向光敏劑EB-ER-Pc的結(jié)構(gòu)和光動(dòng)力治療過(guò)程的示意圖[33]Fig.12 Schematic diagram of the structure and photodynamic therapy process of endoplasmic reticulum targeted photosensitizer EB-ER-Pc[33]

Deng等[34]開發(fā)了還原敏感性聚合物聚乙二醇-ss-1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基-（聚乙二醇）-2000]納米粒子。該納米離子負(fù)載了可以在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中累積的光敏劑，形成Ds-sP/TCPPTER NPs，在激光照射下原位產(chǎn)生ROS，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活免疫細(xì)胞并放大免疫原性死亡（immunogenic cancer cell death，ICD），同時(shí)進(jìn)行光動(dòng)力 -免疫治療（圖 13）。

圖13 Ds-sP/TCPP-TER可以在ER中積累并在NIR激光照射下產(chǎn)生ROS，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激放大免疫原性死亡的示意圖[34]Fig.13 Ds-sP/TCPP-TER can accumulate in the ER and generate ROS under NIR laser irradiation,resulting in ER stress that amplifies ICD[34]

5 總結(jié)與展望

將光敏劑直接運(yùn)送到細(xì)胞器是一種具有前景的腫瘤光動(dòng)力治療策略，可最大限度地發(fā)揮以腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞器為靶點(diǎn)的抗癌光動(dòng)力治療的療效。基于納米載體細(xì)胞器靶向的光敏劑由于具有相對(duì)游離光敏劑更高的抗癌效果、更長(zhǎng)的血液循環(huán)時(shí)間和在指定部位釋藥等優(yōu)點(diǎn)，已受到研究人員廣泛關(guān)注。通過(guò)在細(xì)胞層面的MTT和細(xì)胞增殖試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）試驗(yàn)以及組織層面的蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，H&E）染色證明這些納米載體細(xì)胞器靶向光敏劑具有良好的生物安全性。目前大多數(shù)細(xì)胞器靶向光敏劑都是利用納米載體進(jìn)行遞送的，一些研究還構(gòu)建了診療一體的多功能納米平臺(tái)，有利于腫瘤的精準(zhǔn)個(gè)性化治療。納米載體的出現(xiàn)為理想給藥系統(tǒng)帶來(lái)了新的希望。然而，從基礎(chǔ)研究到臨床轉(zhuǎn)化的過(guò)程中，細(xì)胞器靶向納米載體的研究仍面臨以下問(wèn)題和挑戰(zhàn)：1）開發(fā)更安全、生物相容性更好、可被機(jī)體代謝排泄的細(xì)胞器靶向納米光敏劑載體是今后光敏劑載體研究的重要方向，也是腫瘤細(xì)胞器靶向光動(dòng)力治療能夠進(jìn)入臨床應(yīng)用的前提；2）構(gòu)建模塊化的智能型納米載體，能夠在特定條件刺激下釋放藥物，從而減少藥物進(jìn)入細(xì)胞器之前的泄漏，同時(shí)提升藥物在細(xì)胞器內(nèi)釋放的效率；3）在載體表面修飾各種靶向基團(tuán)是目前實(shí)現(xiàn)納米載體細(xì)胞器靶向功能的重要策略，但還需進(jìn)一步研究攜帶靶向基團(tuán)的納米載體與細(xì)胞器之間的相互作用機(jī)制，這有利于提升納米載體的細(xì)胞器靶向的效率以及光動(dòng)力治療的效果；4）有些細(xì)胞器靶向納米載體具有很好的細(xì)胞器靶向性，但藥物在細(xì)胞器中的釋放不夠高效，因此需要建立并完善納米載體細(xì)胞器靶向效率及藥物釋放效率的評(píng)價(jià)機(jī)制。綜上所述，發(fā)展和優(yōu)化細(xì)胞器靶向納米光敏劑遞送系統(tǒng)以提高腫瘤光動(dòng)力治療效果仍是今后納米光敏劑載體研究的重要方向。