雨生紅球藻己糖激酶基因的克隆和生物信息學(xué)分析

石 穎，宋亞楠，張宏江，季春麗，張春輝，李潤(rùn)植，崔紅利

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，太谷030801）

雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）是一種單細(xì)胞綠藻，屬于團(tuán)藻目（Volvocales），紅球藻科（Haematococceae）[1]。因其多生長(zhǎng)在淡水環(huán)境中，故又被叫做湖生紅球藻或湖生血球藻[2]。雨生紅球藻的整個(gè)生活史大致可以分為營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和蝦青素積累兩個(gè)階段[3]。適宜條件下，雨生紅球藻呈綠色游動(dòng)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，是生物量高密度增長(zhǎng)階段，蝦青素含量較低；脅迫條件下，雨生紅球藻由綠變紅，呈紅色不動(dòng)細(xì)胞，此階段蝦青素在細(xì)胞內(nèi)大量積累[4-6]。蝦青素（astaxanthin）是一種脂溶性色素，顏色艷紅，可以強(qiáng)力清除細(xì)胞內(nèi)的氧自由基，是一種高效的天然抗氧化劑，具有延緩皮膚衰老、增強(qiáng)免疫力等功效，廣泛應(yīng)用于化妝品、食品保健品、飼料添加劑及醫(yī)藥制劑等領(lǐng)域[7-8]。目前，雨生紅球藻被公認(rèn)為是自然界中最為理想的天然蝦青素來源[9]。但是雨生紅球藻中蝦青素的合成與積累總是發(fā)生在不利于藻細(xì)胞生物量積累的誘導(dǎo)脅迫條件下，這兩者之間的矛盾是限制雨生紅球藻中天然蝦青素產(chǎn)量的主要因素[3,10]。因此，如何提高雨生紅球藻的生物量成為解決蝦青素產(chǎn)量低這一問題的關(guān)鍵。相關(guān)文獻(xiàn)表明，充分利用光合微生物的異養(yǎng)能力是提高細(xì)胞生物量的有效方式，培養(yǎng)過程中添加外源糖類對(duì)于提高微藻生物量的作用更為顯著[11]，但是在實(shí)際培養(yǎng)過程中，我們發(fā)現(xiàn)雨生紅球藻不能有效利用外源糖類，同時(shí)有關(guān)其體內(nèi)糖代謝的分子機(jī)制也并不清晰。

己糖激酶（hexokinase，HK）能催化己糖磷酸化，是植物呼吸代謝中的一個(gè)關(guān)鍵酶，是糖分解代謝的重要控制點(diǎn)，具有催化和調(diào)節(jié)的雙重作用[12]。HK不僅能夠調(diào)控植物體內(nèi)游離糖和貯存糖的比率，在糖酵解和戊糖磷酸途徑中具有重要作用[13]，而且還能感知葡萄糖信號(hào)，參與細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)過程，是植物體內(nèi)糖與激素相聯(lián)系的一個(gè)關(guān)鍵元件[14-16]。自1992年Minet等[17]從擬南芥中分離出第一個(gè)植物HK基因起，至今已從數(shù)十個(gè)高等植物（如水稻[18]、木薯[19]、梨[20]、桃[21]、蘋果[22-23]等）中成功分離出了HK基因，并公布了相關(guān)序列，且對(duì)于模式植物HK基因結(jié)構(gòu)和功能的研究越發(fā)成熟。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，植物的HK基因多以基因家族的形式存在[24]。擬南芥（Arabidopsis thaliana）[25]HK基因家族由6種HK基因組成（At-HK1～AtHK6），水稻（Oryza sativaL.）[18]HK基因家族由 10種HK基因組成（OsHK1～OsHK10）。梨（Pyrusspp）果實(shí)中的HK基因在葡萄糖和果糖的積累過程中發(fā)揮著重要的負(fù)調(diào)控作用[20]。在擬南芥中，AtHK1的過度表達(dá)可以提高其幼苗對(duì)外源葡萄糖的敏感度，抑制表達(dá)則降低敏感度[25]。此外，抑制水稻Os-HK10的表達(dá)后，其植株傳粉受到干擾，花粉萌發(fā)率明顯下降[18]。

有關(guān)低等植物藻類HK基因的克隆分析雖鮮有報(bào)道，但Chen等[26]通過同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)編碼HK的基因序列廣泛存在于微藻中，且首次從凱氏擬小球藻（Chlorella kessleri）中克隆獲得了CkeHK基因。目前，有關(guān)雨生紅球藻中HK基因尚未見相關(guān)報(bào)道。開展HaeHK功能的研究是探討雨生紅球藻己糖代謝分子機(jī)制的理想途徑，因此獲得基因序列并進(jìn)行生物信息學(xué)分析是這個(gè)過程中必不可少的一部分。

本文以雨生紅球藻為研究對(duì)象，利用同源克隆和cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)（rapid-amplification of cDNA ends，RACE）結(jié)合的方法克隆獲得了HaeHK基因的cDNA全長(zhǎng)序列，并通過生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)其理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)功能及系統(tǒng)起源進(jìn)化等方面進(jìn)行了分析和預(yù)測(cè)，為進(jìn)一步研究HaeHK的功能及雨生紅球藻己糖代謝分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為通過基因編輯手段實(shí)現(xiàn)添加外源糖類進(jìn)行雨生紅球藻異養(yǎng)培養(yǎng)提供了線索，對(duì)于構(gòu)建性狀優(yōu)良藻株具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及培養(yǎng)條件

本研究所用雨生紅球藻保存于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所藻種庫(kù)。將雨生紅球藻接種于MCM（modofoed Chalmers medium）培養(yǎng)基上，于（22±1）℃、光照條件下靜置培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為25μmol/(m2·s)，光/暗周期為12 h/12 h，且每8 h震蕩搖勻1次。所用大腸桿菌菌種為本實(shí)驗(yàn)室所保存的Top 10。MCM培養(yǎng)基配方見表1。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雨生紅球藻細(xì)胞，用TRI-zol試劑盒提取總RNA（具體過程參考產(chǎn)品說明書），使用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并利用超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度（A260/A280）[27]。

表1 MCM培養(yǎng)基配方Tab.1 MCM medium formula

1.2.2 模板的制備

參照TaKaRa公司的試劑盒（PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser）合成雨生紅球藻cDNA模板；參照Clontech公司的試劑盒（SMARTer TM RACE cDNA Amplication Kit）進(jìn)行 RACE模板的制備[10]。

1.2.3HaeHK基因克隆

利用 GenBank下載團(tuán)藻（Volvox carteri）、萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）、盤藻（Gonium pectoral）、膠球藻 C-169（Coccomyxa subellipsoideaC-169）等編碼HK基因的cDNA序列進(jìn)行比對(duì)分析，通過CODEHOP軟件設(shè)計(jì)兼并引物，根據(jù)同源克隆片段設(shè)計(jì)RACE引物[10]，引物由上海生工生物工程有限公司合成。表2所示即為所設(shè)計(jì)引物信息。

以之前制備的雨生紅球藻cDNA為模板，用合成的兼并引物RT-PCR擴(kuò)增HaeHK基因的cDNA同源片段。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性 45 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 130 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃終止。循環(huán)結(jié)束后，PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。在獲得同源克隆片段的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)兩端RACE引物（表2），以之前制備的RACE cDNA為模板，按照試劑盒說明書進(jìn)行5'端和3'端片段的PCR。所得產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、連接、轉(zhuǎn)化及挑選陽(yáng)性克隆測(cè)序。

1.3 HaeHK基因的生物信息學(xué)分析

利用軟件（SeqMan software of DNAStar 7.1）對(duì)中間同源克隆片段和兩端RACE片段拼接獲得HaeHK基因cDNA全長(zhǎng)序列。

通過序列處理在線工具包（the sequence manipulation suite，SMS）將獲得的HaeHK的cDNA全長(zhǎng)序列翻譯成氨基酸序列，并通過ORF finder軟件查找到目的基因的開放閱讀框；理化性質(zhì)分析通過軟件ProtParam完成；HaeHK蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)分別利用在線軟件SOPMA和SWISS-MDEL進(jìn)行預(yù)測(cè)；亞細(xì)胞定位通過PSORT軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)；信號(hào)肽通過SignalP-5.0軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)；跨膜結(jié)構(gòu)域利用TMHMM軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)分析；磷酸化位點(diǎn)通過軟件NetPhos-3.1進(jìn)行預(yù)測(cè)；HaeHK蛋白的保守結(jié)構(gòu)域通過NCBI的CCD在線軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)；通過在線BLAST程序?qū)δ康幕蜻M(jìn)行鑒定并下載同源相似序列，利用BioEdit及Clustal W軟件對(duì)多序列進(jìn)行比對(duì)分析，再通過軟件MEGA繪制進(jìn)化樹[28-31]。

2 結(jié)果與分析

2.1 HaeHK全長(zhǎng)cDNA克隆

本研究以雨生紅球藻總RNA反轉(zhuǎn)錄所得到的cDNA作為模板，設(shè)計(jì)特異性引物（HK-F/HK-R），經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得cDNA中間片段。根據(jù)中間片段分別設(shè)計(jì)特異性引物（HaeHK51/HaeHK52和HaeHK31/HaeHK32），并通過RACE擴(kuò)增獲得該序列的5'端和3'端（圖1）。拼接所獲得的5'端、中間片段和3'端序列即可獲得HK基因的cDNA全長(zhǎng)序列。

表2 本文所用的引物信息Tab.2 Primer information used in this article

表3 生物信息學(xué)分析所用的網(wǎng)絡(luò)資源Tab.3 Network resources of bioinformatics analysis

圖1 雨生紅球藻總RNA的提取及HaeHK基因克隆Fig.1 Total RNA of Haematococcus pluvialis and clonging of HaeHK

該基因cDNA全長(zhǎng)為2 047 bp（NCBI注冊(cè)號(hào)：MN082392），編碼區(qū)從 101 ～ 1 816共 1 716 bp，編碼571個(gè)氨基酸，5'非編碼區(qū)（5'UTR）序列長(zhǎng)100 bp，3'非編碼區(qū)（3'UTR）序列長(zhǎng)231 bp，并帶有poly(A)尾巴（圖2）。利用BLAST程序?qū)λ@得的HaeHK蛋白氨基酸序列與團(tuán)藻和萊茵衣藻的HKs序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與團(tuán)藻的HK同源性為50%，與萊茵衣藻HK的同源性為46%。

2.2 HaeHK蛋白的基本理化性質(zhì)分析

ProtParam軟件分析結(jié)果顯示，HaeHK蛋白分子式為C2664H4224N762O797S29，該蛋白的預(yù)測(cè)分子量為60.61 kD，等電點(diǎn)（pI）為6.49。編碼該蛋白的氨基酸共有20種，其中含量較高的氨基酸為丙氨酸（Ala，12.6%）和亮氨酸（Leu，11.4%），而色氨酸（Trp）、絡(luò)氨酸（Tyr）、天冬酰胺（Asn）含量較低，分別為 1.6%、1.6%和1.4%。堿性（帶負(fù)電荷）氨基酸殘基總數(shù)（Asp+Glu）共53個(gè)，酸性（帶正電荷）氨基酸殘基（Arg+Lys）共48個(gè)。該蛋白的消光系數(shù)為62 420，吸光系數(shù)為1.030；蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為40.76，脂肪酸系數(shù)為86.02，為較穩(wěn)定蛋白；總平均親水系數(shù)為0.013，為疏水性蛋白。通過PSORTⅡ軟件對(duì)HaeHK蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示HaeHK蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中，可判斷為胞內(nèi)蛋白。軟件SignalP-5.0預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，編碼HaeHK蛋白的氨基酸序列中沒有信號(hào)肽序列。TMHMM軟件結(jié)果顯示，HaeHK蛋白中沒有跨膜結(jié)構(gòu)域，是可溶性蛋白。利用NetPhos-3.1軟件預(yù)測(cè)到：HaeHK蛋白絲氨酸激酶（Ser）的磷酸化位點(diǎn)最多，為44個(gè)，在C端分布比較緊密；蘇氨酸激酶（Thr）的磷酸化位點(diǎn)有34個(gè)，且分布不均；絡(luò)氨酸激酶（Tyr）的磷酸化位點(diǎn)最少，為6個(gè)。

圖2 HaeHK基因的cDNA全長(zhǎng)核苷酸序列和氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of the full-length cDNA of HaeHK

2.3 HaeHK蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用軟件SOPMA對(duì)HaeHK蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示：無規(guī)則卷曲占的比列最高，為44.66%；其次為α-螺旋，占比37.13%；延伸鏈和β-折疊分別為12.78%和5.43%。由此可說明，HaeHK蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)卷曲和α-螺旋組成，為混合型蛋白。

2.4 HaeHK蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用在線軟件SWISS-MODEL對(duì)HaeHK蛋白的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析與同源建模。模板為水稻OsHK6蛋白（圖3a），該蛋白與HaeHK蛋白的氨基酸序列相似性為39%，覆蓋度為77%，保守序列范圍為第49～522位氨基酸。X射線衍射發(fā)現(xiàn)HaeHK蛋白形成了典型“蝴蝶”型空間構(gòu)象（圖3b），其中包含1個(gè)大亞結(jié)構(gòu)和1個(gè)小亞結(jié)構(gòu)，具有典型的HK超家族特征，同時(shí)存在葡萄糖結(jié)合位點(diǎn)和己糖結(jié)合位點(diǎn)，說明HaeHK可以催化葡萄糖及其他己糖。

2.5 HaeHK蛋白的序列比對(duì)及結(jié)構(gòu)域分析

利用SMART和CDD軟件分析了HaeHK中的保守結(jié)構(gòu)域，其中在第254～1 672位氨基酸處存在1個(gè)結(jié)構(gòu)域，即PLN02914，屬于HK超家族中的一員（圖 4a）。

為了進(jìn)一步研究HaeHK蛋白中的保守結(jié)構(gòu)域，本研究對(duì)來源于7種藻類以及擬南芥的HKs氨基酸序列進(jìn)行了比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)序列間的同源性較高。如圖4b所示，HaeHK蛋白含有ATP結(jié)合位點(diǎn)（CD1:A DLGGTN RV;CD4:I GTGIN;CD7:A DGG）、HK結(jié)合位點(diǎn)（CD2:GF FSF）和葡萄糖激酶結(jié)合位點(diǎn)（ND E E）。

2.6 HaeHK的起源和系統(tǒng)進(jìn)化分析

本文比對(duì)了來自低等植物藻類和高等植物等共17個(gè)不同物種的HKs氨基酸序列，并利用MEGA-7軟件構(gòu)建進(jìn)化樹，分析了HaeHK的進(jìn)化關(guān)系（圖5）。結(jié)果表明，進(jìn)化樹中來源于17個(gè)物種的HKs蛋白聚為低等藻類和陸生高等植物2支，其中HaeHK與真核綠藻HKs（萊茵衣藻、團(tuán)藻和盤藻）聚為1類，且進(jìn)化關(guān)系與物種進(jìn)化過程相吻合。這些結(jié)果進(jìn)一步暗示低等植物藻類和高等植物來源HKs具有共同的祖先。

圖 3 OsHK6（a）和 HaeHK（b）蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.3 Tertiary structure of OsHK 6(a)and HaeHK(b)

圖4 HaeHK的結(jié)構(gòu)域（a）及氨基酸序列比對(duì)分析（b）Fig.4 The structural domain(a),amino acid sequence alignment(b)analysis of HaeHK

圖5 HaeHK與其他物種HKs的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.5 Phylogenetic tree of HKs of Haematococcus pluvialis and other species

表4 HK基因名稱及其登錄號(hào)Tab.4 HK genes and their GenBank accession numbers

3 討論

糖類又稱碳水化合物，由C、H、O 3種元素構(gòu)成，大致可以分為單糖、二糖和多糖等[32]。糖類對(duì)于微藻及植物是至關(guān)重要的，并且在其生長(zhǎng)、發(fā)育和代謝中發(fā)揮著多重作用[33]。在植物的整個(gè)生命歷程中，糖類作為呼吸作用的底物，為生物體提供了生長(zhǎng)發(fā)育及代謝過程中所需的能量。作為光合作用的產(chǎn)物，為生物體提供養(yǎng)分的同時(shí)還對(duì)源庫(kù)關(guān)系具有一定的調(diào)控作用。糖類的分解與合成會(huì)造成細(xì)胞滲透勢(shì)的變化，這是影響植物抗逆能力的因素之一。糖代謝與核酸代謝、蛋白質(zhì)代謝、脂類代謝以及次生物質(zhì)代謝之間有著密不可分的關(guān)系[34-35]。此外，糖類也可以作為信號(hào)分子參與植物的糖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，從而調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)[36-37]。

生物體內(nèi)，己糖經(jīng)過HK磷酸化作用后才可進(jìn)入細(xì)胞糖酵解途徑，進(jìn)而為植物的各項(xiàng)生命活動(dòng)提供能量及中間代謝產(chǎn)物[38]。HK在生物體內(nèi)具有催化和調(diào)節(jié)的雙重作用[30]。植物的HK基因多以基因家族的形式存在，且同一物種中的不同HK基因家族也存在明顯的分化，表明HK基因會(huì)隨著植物體的進(jìn)化不斷進(jìn)化，從而產(chǎn)生擁有其他特異功能的家族成員[24]。

本研究以雨生紅球藻作為研究對(duì)象，克隆獲得其HaeHK基因的cDNA全長(zhǎng)序列，同源比對(duì)分析顯示其與團(tuán)藻以及萊茵衣藻的序列相似程度較高，分別達(dá)到50%和46%，暗示了該基因可能是編碼HaeHK的基因。高等植物的HK依據(jù)其結(jié)構(gòu)特征可劃分為3個(gè)亞類：Type A、B和C。其中，Type A是一類具有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的HK，定位于葉綠體中，如水稻OsHK4、煙草NtHK2和番茄LeHK4等；Type B是一類具有N端疏水膜錨定域的HK，定位于線粒體中，如擬南芥 AtHK1、AtHK2 及番茄 LeHK1、LeHK2、LeHK3等；Type C是一類N端既沒有葉綠體（質(zhì)體）信號(hào)肽也沒有膜錨定特征結(jié)構(gòu)域的HK，定位于細(xì)胞質(zhì)中，如水稻 OsHK1、OsHK7、OsHK8 等[12,39-40]。定位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的HaeHK蛋白，為胞內(nèi)蛋白，既沒有葉綠體信號(hào)肽也沒有跨膜結(jié)構(gòu)域，可見HaeHK蛋白的結(jié)構(gòu)可能類似于水稻OsHK1，屬于Type C。結(jié)構(gòu)分析表明，HaeHK基因編碼的蛋白具有ATP結(jié)合位點(diǎn)、HK結(jié)合位點(diǎn)以及葡萄糖糖結(jié)合域，且高級(jí)結(jié)構(gòu)呈典型“蝴蝶”結(jié)構(gòu)。這些都是HK家族的顯著特征，且與擬南芥等植物中的發(fā)現(xiàn)相似，這些結(jié)果都能進(jìn)一步證明該基因能編碼HaeHK。HaeHK蛋白的進(jìn)化分析結(jié)果顯示，HaeHK與其他真核綠藻HKs聚為一支，高等植物聚為另外一支，進(jìn)一步暗示低等植物藻類和高等植物來源HKs來自共同祖先。HK基因隨著個(gè)體的發(fā)展不斷進(jìn)化，產(chǎn)生具有各異功能的家族成員，植物體進(jìn)化程度越高，HK基因家族成員可能就越多，HK在生物體中發(fā)揮的作用更加多樣。

綜上所述，本研究為HaeHK基因的表達(dá)及功能研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為解析雨生紅球藻己糖利用及代謝的分子機(jī)制提供了線索，并有助于推進(jìn)異養(yǎng)微藻代謝的相關(guān)研究。雨生紅球藻是光合自養(yǎng)型微生物，在自然條件下生長(zhǎng)緩慢，且不能有效地利用外源糖類進(jìn)行異養(yǎng)。那么，雨生紅球藻中的己糖代謝途徑與小球藻等真核綠藻中的糖代謝途徑有何不同？雨生紅球藻中的HaeHK基因如何表達(dá)，它在整個(gè)糖代謝過程中扮演什么角色？隨著基因編輯手段的發(fā)展應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)添加外源糖類進(jìn)行雨生紅球藻的異養(yǎng)培養(yǎng)對(duì)其整個(gè)己糖代謝過程有何影響？其中HK的表達(dá)進(jìn)程是否改變？光對(duì)雨生紅球藻中蝦青素的積累具有明顯的調(diào)控作用，同時(shí)光照在藻細(xì)胞糖積累過程中也起著至關(guān)重要的作用，那光和糖在雨生紅球藻的生長(zhǎng)過程中是否具有協(xié)同作用？這些問題都有待深入研究，也將是我們今后工作的重點(diǎn)。