萊菔硫烷預先給藥對兔單肺通氣時肺損傷Nrf2蛋白變化及抗肺損傷的機制

李榮華 胡秀才 單士強 李永博 崔文斌 劉玲玲

(滄州市中心醫(yī)院麻醉一科,河北 滄州 061000)

臨床研究證實長時間的單肺通氣(OLV)可增加肺損傷發(fā)生的危險性，影響患者預后及術(shù)后康復〔1〕。核因子NF-E2相關(guān)因子(Nrf)2和急性肺損傷的發(fā)生密切相關(guān)，是機體中調(diào)節(jié)炎性反應、氧化/還原反應的重要轉(zhuǎn)錄因子〔2〕。萊菔硫烷(SFN)主要來源于甘藍、西蘭花、花菜等十字花科蔬菜中，屬于可食用的異硫氰酸鹽，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎性反應等作用，作為化學預防藥物已引起廣大研究者的關(guān)注〔3〕。研究報道，SFN能有效抑制重癥急性胰腺炎大鼠肺組織炎性反應，降低細胞氧化應激水平，減輕大鼠肺臟組織水腫〔4〕。本研究擬評價SFN預先給藥對OLV兔肺組織Nrf2蛋白表達的影響及機制。

1 材料與方法

1.1對象 取河北醫(yī)科大學實驗中心24只健康雄性大白兔，平均(5.01±1.21)月齡，體重2.3～3.5 kg，平均(2.86±0.45)kg，按照隨機數(shù)字表法分為雙肺通氣(TLV)組、OLV組及SFN預先給藥OLV(SFN)組各8只，其中TLV組3～7月齡，平均(4.89±1.12)月齡，體重2.3～3.3 kg，平均(2.81±0.43)kg；OLV組4～8月齡，平均(4.92±1.19)月齡，體重2.4～3.5 kg，平均(2.92±0.46)kg；SFN組3～8月齡，平均(4.05±1.25)月齡，體重2.3～3.5 kg，平均(2.83±0.43)kg，3組一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。TLV組在氣管置入單腔氣管導管行雙肺通氣，OLV組、SFN組在右主支氣管置入單腔氣管導管行OLV。SFN組于OLV前30 min以5 mg/kg SFN行腹腔注射，OLV組和TLV 組同時點給予等量羥甲基纖維素鈉的溶媒。

1.2建立OLV模型 參照林文前等〔5〕研究方法建立OLV誘發(fā)肺損傷模型。將大白兔常規(guī)禁食水數(shù)小時后，給予30 mg/kg、3%戊巴比妥鈉于兔右側(cè)耳緣靜脈注射進行麻醉后，常規(guī)備皮，消毒。將右側(cè)股動脈游離以用于監(jiān)測平均動脈壓(MAP，多道生理記錄儀 GY-6000F)及取動脈血行血氣分析(美國麥迪卡medica EasyStat 全自動血氣分析儀)。給予局麻將頸部皮膚切開，行氣管切開術(shù)。TLV組在氣管置入單腔氣管導管(ID3.0 mm)行TLV，OLV組、SFN組在右主支氣管置入單腔氣管導管(ID3.0 mm)行OLV(DHX-300動物呼吸機，北京金洋萬達科技有限公司)。導管位置通過聽診氣道壓力、右側(cè)呼吸音及觀察右側(cè)胸廓運動等變化進行判斷及調(diào)整。均采用容量通氣模式進行通氣，參數(shù)為氧濃度分數(shù)(FiO2)100%，血氧飽和度(SpO2)大于90%，TLV組雙肺通氣3 h，OLV、SFN組右肺OLV 3 h。將大白兔擺右側(cè)臥位，穩(wěn)定10 min后將0.1 mg/kg維庫溴銨靜脈注射于右頸內(nèi)，等無自主呼吸后將呼吸機連接行機械通氣。OLV組、SFN組先行50 min OLV，再行10 min雙肺通氣(將氣管導管退至氣管內(nèi)，通氣參數(shù)如上)，再將上述通氣過程重復一遍。并在左側(cè)5～6肋間作一小切口至白兔胸腔，以對左肺復張及萎縮情況進行觀察。在術(shù)中給予0.1 ng/kg維庫溴銨、1% 1 ml戊巴比妥鈉間斷追加，以維持肌送和麻醉，再予10 ml/(kg·h)乳酸鈉林格氏液輸注于右頸內(nèi)靜脈，以補給實驗過程中大白兔損失的體液，保障MAP穩(wěn)定。在通氣開始(T0)、通氣1 h(T1)、2 h(T2)、3 h(T3)取動脈血檢測血氧分壓(PaO2)，再計算氧合指數(shù)(PaO2/FiO2)。實驗結(jié)束后將大白兔通過頸動脈快速放血法處死，摘除右肺稱濕重(W)，并取肺下葉1×1×2 cm3肺組織分成等大兩份，一份通過4℃ 4%多聚甲醛固定待測，另一份先用液氮凍存1 d再轉(zhuǎn)-80℃保存待測。將右肺放在80℃烤箱中烘烤72 h，再稱取干重(D)，計算W/D。

1.3肺組織病理學觀察 將1.0 cm3肺組織采用4%多聚甲醛固定常規(guī)脫水、包埋、切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，再通過光學顯微鏡觀察3組肺組織病理學改變，并進行肺損傷評分。每組切片均隨機選取10個高倍視野進行評分，取平均值。評估內(nèi)容包括肺泡內(nèi)充血、中性粒細胞浸潤、肺泡水腫、肺間質(zhì)水腫等方面，計為0～4分，0分為輕微或無變化，1分為輕度變化，2分為中度變化，3分為重度變化，4分為極重度變化〔6〕。

1.4指標檢測 將-80℃保存的兔肺組織取出，通過化學比色法檢測超氧化物歧化酶(SOD)活性，丙二醛(MDA)含量，嚴格按照試劑盒(深圳子科生物科技有限公司)說明書進行檢測。其中通過硫代巴比妥酸法檢測MDA濃度，黃嘌呤氧化酶法檢測SOD活性。酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6、IL-8濃度，嚴格按照試劑盒(合肥博美生物科技有限責任公司)說明書進行檢測。兔肺組織中的血紅素氧合酶(HO)-1、Nrf2濃度采用Western印跡法〔7〕進行檢測。

1.5統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0軟件行t檢驗、F檢驗、SNK-q檢驗、χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.13組各時點氧合指數(shù)比較 3組T0、T1時氧合指數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，T2時OLV、SFN組明顯低于TLV組(P<0.05)，T3時OLV、SFN組明顯低于TLV組，但SFN組明顯高于OLV組(P<0.05)，T2、T3時OLV、SFN組明顯明顯低于T0時(P<0.05)，見表1。

表1 3組各時點氧合指數(shù)比較

2.23組相關(guān)指標比較 TLV組光鏡下結(jié)果顯示兔右肺組織中有完整性較高的肺泡結(jié)構(gòu)，肺泡腔內(nèi)較少炎性細胞浸潤，間質(zhì)輕度增厚，出血少，未見明顯滲出；OLV組兔右肺組織中較多肺泡結(jié)構(gòu)消失，肺泡腔內(nèi)較多炎性細胞浸潤，間質(zhì)增厚明顯，出血多，滲出明顯；SFN組兔右側(cè)肺組織肺泡結(jié)構(gòu)有破壞，肺泡腔內(nèi)較少炎性細胞浸潤，間質(zhì)增厚，出血少，少量滲出。OLV組、SFN組Nrf2、HO-1蛋白表達、肺損傷評分、W/D明顯高于TLV組(P<0.05)，SFN組Nrf2、HO-1蛋白表達明顯高于OLV組，肺損傷評分、W/D明顯低于OLV組(P<0.05)，見表2。

表2 3組相關(guān)指標比較

2.33組氧化應激及炎性因子指標比較 OLV組、SFN組MDA表達及TNF-α、IL-6、IL-8濃度明顯高于TLV組，SOD活性明顯低于TLV組(P<0.05)，SFN組MDA表達及TNF-α、IL-6、IL-8濃度明顯低于OLV組，SOD活性明顯高于OLV組(P<0.05)，見表3。

表3 3組氧化應激及炎癥因子指標比較

3 討 論

非通氣側(cè)肺主要是由肺組織的再灌注損傷、復張時機械牽張性損傷及萎陷時的缺氧性損傷所導致，通氣側(cè)肺則由通氣過量所引起的機械通氣性肺損傷及所誘發(fā)的肺組織炎性反應所致〔8，9〕。研究報道，OLV所誘發(fā)的肺損傷可能和脂質(zhì)過氧化反應及炎性反應增加密切相關(guān)〔10〕。因終末肺泡的氧供主要來源于肺動脈及肺泡內(nèi)氣體，而肺動脈中是混合靜脈血，OLV時萎陷的肺泡缺氧及可發(fā)生缺氧性肺血管收縮，進而導致肺組織低氧狀態(tài)。肺泡的萎陷與復張及缺氧可增加氧化應激反應，生成過量的氧自由基，同時可激活中性粒細胞在肺組織中聚集，從而生成大量的炎性介質(zhì)。生物膜上的不飽和脂肪酸可與氧自由基發(fā)生脂質(zhì)過氧化作用，生成MOD等脂質(zhì)過氧化物，對生物膜造成破壞，從而可直接對肺實質(zhì)細胞造成損傷〔11〕。此外MOD等脂質(zhì)過氧化物還可對肺毛細血管基底膜等肺間質(zhì)成分，誘發(fā)肺水腫。SOD可有效將機體中氧自由基清除，但當MOD等脂質(zhì)過氧化物過量時可消耗大量SOD，降低血中活性。TNF-α、IL-6、IL-8等炎性因子促發(fā)的肺組織炎性反應，可對血管內(nèi)皮細胞、肺泡上皮細胞造成損傷，導致肺毛細血管通透性增加、肺泡上皮細胞變性壞死及肺血管痙攣，進而引起肺泡及間質(zhì)炎性細胞浸潤、水腫及出血，導致肺損傷〔12，13〕。

Nrf2是調(diào)節(jié)炎性反應、氧化/還原反應的重要轉(zhuǎn)錄因子，正常情況下Nrf2與Keapl結(jié)合在胞質(zhì)中，并在肌動蛋白構(gòu)成的細胞骨架上固定，不能進到細胞核中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性作用，且被相關(guān)蛋白酶體途徑降解。當細胞受到親電子化合物、活性氧簇等刺激時，可與Keapl分離，進入細胞核中合成異二聚體結(jié)合ARE序列，從而可啟動Ⅱ相解毒酶基因及抗氧化應激蛋白基因等受ARE調(diào)控的相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，受ARE調(diào)控的基因大多可編碼多種抗炎、抗氧化作用的蛋白如HO-1、醌氧化還原酶1等〔14，15〕。其中HO-1具有顯著的抗炎、抗氧化作用，可有效抑制炎性反應，降低肺損傷程度。而抗氧化酶類可發(fā)揮抗氧化功能，清除自由基，保障肺組織的正常功能〔16〕。SFN屬于異硫氰酸酯類，具有保護細胞、抗氧化、抗炎、抗癌等多種生理學功能。研究發(fā)現(xiàn)，SFN能通過Nrf2途徑上調(diào)HO-1、NADPH泛醌氧化還原酶-1等抗氧化酶表達，最終在機體內(nèi)發(fā)揮抗氧化功能〔17〕。周亞東等〔18〕研究指出，SFN可以通過激活動物體內(nèi)Nrf2信號傳導通路，調(diào)節(jié)下游多種細胞因子表達，進而緩解組織中的炎性反應，推測Nrf2可以當作肺保護性治療的一個靶點。氧合指數(shù)在臨床上常用于反映呼吸功能，當?shù)陀?00 mmHg時可認為有急性肺損傷〔19〕。本研究結(jié)果提示，SFN預先給藥可減輕肺損傷；另外，SFN可促進肺組織中Nrf2表達，提高HO-1等抗氧化酶濃度，發(fā)揮抗氧化、抗炎作用；SFN也可有效抑制肺組織中脂質(zhì)過氧化反應及炎性反應，可通過激活Nrf2表達，上調(diào)HO-1等下游多種細胞因子的表達來發(fā)揮抗氧化、抗炎作用及自身的抗氧化、抗炎等生理學功能發(fā)揮協(xié)同抗氧化和抗炎的雙重生物學作用，從而達到肺組織損傷的保護作用。