托瑞米芬逆轉(zhuǎn)肺癌耐藥細(xì)胞株A549/cDDP耐藥性的應(yīng)用

顧晶晶 張敬毅 孫平 田桂珍

(1淄博市第四人民醫(yī)院藥劑科，山東 淄博 255067；2淄博市第一醫(yī)院藥學(xué)部)

肺癌是臨床上比較常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，目前臨床對(duì)其治療主要手段之一為化療，但對(duì)于化療周期較長(zhǎng)的患者來(lái)講，可能出現(xiàn)癌細(xì)胞對(duì)治療藥物產(chǎn)生一定的抗藥性，直接影響化療效果〔1～4〕。因此臨床對(duì)于能否應(yīng)用藥物來(lái)改善癌細(xì)胞對(duì)治療藥物的敏感性，并逆轉(zhuǎn)耐藥性是臨床比較關(guān)注的問(wèn)題。相關(guān)研究指出，通過(guò)托瑞米芬(TOR)的應(yīng)用，可增加多種肺癌耐藥細(xì)胞株的敏感度，并對(duì)其產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)作用〔5～7〕，本文擬分析TOR對(duì)耐順鉑(CDDP)細(xì)胞株A549的逆轉(zhuǎn)作用。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 肺癌耐藥細(xì)胞株A549/cDDP：使用大劑量的cDDP連續(xù)沖擊12次以上后獲得，沖擊后經(jīng)四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)后顯示其耐藥指數(shù)為4.2。枸櫞酸TOR：生產(chǎn)廠家為福安藥業(yè)集團(tuán)寧波天衡制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20020047。CDDP：生產(chǎn)廠家為齊魯制藥有限公司。Annexin V/PI 雙染色細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、IMDM 培養(yǎng)基、二甲基亞砜及MTT均購(gòu)于上海鈺博生物科技有限公司。

1.2TOR母液的配置方法 稱(chēng)取枸櫞酸TOR 2.99 g，將其與5 ml二甲基亞砜進(jìn)行充分溶解，并加入無(wú)血清IMDM 5 ml，混合均勻后即得到500 μmol /L的TOR母液。對(duì)其進(jìn)行除菌、分裝后在常溫下保存，并避免陽(yáng)光照射。

1.3MTT檢測(cè) 應(yīng)用MTT法檢測(cè)TOR聯(lián)合cDDP及單純應(yīng)用cDDP對(duì)肺癌耐藥細(xì)胞株A549/cDDP藥物敏感性的影響。首先將選定的A549/cDDP菌株進(jìn)行復(fù)蘇處理并培養(yǎng)，當(dāng)其達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)期后，對(duì)其使用胰蛋白酶(0.25%)進(jìn)行消化處理，然后使用生理鹽水進(jìn)行洗滌，洗滌后計(jì)數(shù)。取胎牛血清IMDM 培養(yǎng)液(體積分?jǐn)?shù)為10%)配置成單個(gè)細(xì)胞懸液(5×104ml)，將其接種于96孔培養(yǎng)板中， 100 μl/孔，將其放置在濃度為5%的CO2培養(yǎng)箱中，溫度保持在37℃，在此種環(huán)境下放置一夜，保持其生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞壁貼壁時(shí)即代表生長(zhǎng)較好。將其分為單獨(dú)cDDP組、5 μmol/L TOR聯(lián)合cDDP組及10 μmol/L TOR聯(lián)合cDDP組，其中單獨(dú)cDDP組濃度分別為200、100、50、20、10、5 μmol/L。以上各種藥物濃度均設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，并設(shè)置陰性對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、5 μmol/L TOR對(duì)照組及10 μmol/L TOR對(duì)照組，其中陽(yáng)性對(duì)照組中含有1%的二甲基亞砜，陰性對(duì)照組為等體積的無(wú)血清二甲基亞砜。然后加入受試藥物cDDP，最后的濃度為200 μmol/L、100 μmol/L、50 μmol/L、20 μmol/L、10 μmol/L及5 μmol/L；將濃度為5 μmol/L和10 μmol/L的 TOR放置在飽和濕度，溫度為37℃及5% CO2的環(huán)境下進(jìn)行靜止培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為68 h，然后加入濃度為5 mg/ml的MTT 20 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，培養(yǎng)滿(mǎn)72 h后去除上清液，同時(shí)加入二甲基亞砜15 μl/孔，充分震蕩10 min后，觀察結(jié)晶全部溶解后使用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度值(A)，波長(zhǎng)為492 nm。

1.4計(jì)算公式 藥物對(duì)細(xì)胞抑制率=陽(yáng)性對(duì)照孔A-加藥孔A/陽(yáng)性對(duì)照孔A×100%。半數(shù)抑制濃度(IC50) 根據(jù)曲線(xiàn)方程求得。逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=cDDP IC50/(cDDP+TOR)IC50。

1.5使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)cDDP及cDDP+TOR聯(lián)合用藥誘導(dǎo)肺癌耐藥細(xì)胞株A549/cDDP 采用Annexin V/PI 雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡和藥物濃度，所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明展開(kāi)，采用Coulter XL-MCL 流式細(xì)胞儀收集細(xì)胞，每個(gè)樣本均收集10 000個(gè)細(xì)胞。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行t和χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1MTT 比色試驗(yàn)結(jié)果 當(dāng)單獨(dú)TOR濃度為5 μmol/L和10 μmol/L時(shí)，其對(duì)于A549/cDDP細(xì)胞的增殖未造成明顯影響(P>0.05)；當(dāng)TOR和cDDP共同應(yīng)用時(shí)， 5 μmol/L和10 μmol/L濃度均能提高cDDP對(duì)于A549/cDDP細(xì)胞的敏感性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 TOR聯(lián)合cDDP及單獨(dú)應(yīng)用cDDP對(duì)肺癌耐藥細(xì)胞株A549/cDDP藥物敏感性的影響

2.2cDDP+TOR 聯(lián)合用藥逆轉(zhuǎn)肺癌耐藥細(xì)胞株A549/cDDP對(duì)cDDP的耐藥性 cDDP濃度為200、100、50、20、10、5 μmol/L時(shí)均可抑制A549/cDDP 細(xì)胞，且隨著濃度的上升，其抑制程度也會(huì)增加。當(dāng)cDDP 與TOR 聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，cDDP濃度為10 μmol/L或者5 μmol/L，均可提升cDDP對(duì)于A549/cDDP 細(xì)胞的敏感性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.879，P=0.002)，IC50 值為39.04 μmol/L時(shí)，其逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為2.04 倍，IC50 值為30.61 μmol/L時(shí)，其逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為2.61倍當(dāng)cDDP 濃度為200 μmol/L時(shí)，cDDP+TOR終濃度5 μmol和cDDP+TOR終濃度10 μmol/L之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.657，P=0.000)，其他濃度時(shí)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.005)。cDDP+TOR 終濃度5 μmol/L與cDDP+TOR 終濃度10 μmol/L之間僅在cDDP濃度為200 μmol/L時(shí)兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.965，P=0.006)。見(jiàn)圖1。

圖1 為T(mén)OR逆轉(zhuǎn)cDDP對(duì)A549/cDDP抑制曲線(xiàn)

3 討 論

隨著人們生活習(xí)慣及生活環(huán)境的改變，罹患肺癌的人群越來(lái)越多，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)作為最為常見(jiàn)的肺癌類(lèi)型具有較高的死亡率。在既往研究中指出，NSCLC具有天然的耐藥性，且耐藥群體比較廣，在化療過(guò)程中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)癌細(xì)胞對(duì)化療藥物耐藥的情況出現(xiàn)，這直接導(dǎo)致化療效果下降，影響治療效果〔5,7〕。針對(duì)此問(wèn)題臨床很多學(xué)者均進(jìn)行了研究，且指出NSCLC患者的癌細(xì)胞組織中雌激素受體(ER) 水平相對(duì)較高，且ER水平的高低及其陽(yáng)性表達(dá)率與肺癌的分化程度有一定關(guān)系，同時(shí)與組織學(xué)類(lèi)型也有著密切的關(guān)系〔8～11〕。

TOR是ER的拮抗劑，其在1979年研制出的一種抗腫瘤藥物。其與傳統(tǒng)的拮抗劑相比，在治療腫瘤方面具有毒性小，副作用少的作用，同時(shí)還具有不致癌、不致畸的特點(diǎn)，當(dāng)其與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，其可以逆轉(zhuǎn)藥物耐藥作用，增加抗腫瘤藥物的敏感性〔8～10〕。

相關(guān)研究指出，TOR的逆轉(zhuǎn)藥物耐藥作用及增加抗腫瘤藥物的敏感性〔11～13〕，其主要機(jī)制如下：(1)TOR在機(jī)體的代謝中發(fā)揮了很大作用，作用之一即抑制蛋白激酶C 的活性，同時(shí)還會(huì)降低P 糖蛋白的活性及降低磷酸化水平，在此種作用下使其逆轉(zhuǎn)肺癌的多種藥物耐藥。(2)肺癌組織具有一定的特點(diǎn)，臨床顯示此類(lèi)患者的ER均呈高表達(dá)狀態(tài)， TOR和ER結(jié)合對(duì)于已經(jīng)產(chǎn)生激素依賴(lài)的肺癌組織產(chǎn)生了明顯的抑制作用〔14,15〕。ER是一種Ca2+，同時(shí)也是磷脂依賴(lài)性蛋白激酶，其直接參與了癌細(xì)胞的分化、增殖過(guò)程，并起到了重要作用，同時(shí)也會(huì)對(duì)P-gp和MDR1 基因造成一定的影響。TOR作為ER抑制劑其較高的化學(xué)活性降低了P-gp 磷酸化水平，達(dá)到逆轉(zhuǎn)耐藥的作用。同時(shí)，PKC 也可促使Topo和LRP的磷酸化，當(dāng)PKC活性增加后介導(dǎo)了多藥耐藥，此種途徑也是TOR發(fā)揮逆轉(zhuǎn)耐藥作用的渠道之一。(3)TOR 對(duì)Ca2+具有雙向調(diào)節(jié)的作用，對(duì)于高濃度的TOR 可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞信號(hào)傳遞過(guò)程中，Ca2+發(fā)揮了重要作用，其涉及細(xì)胞內(nèi)廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。當(dāng)Ca2+水平上升時(shí)，可激活系列Caspase 胞質(zhì)內(nèi)蛋白酶和核酸內(nèi)切酶門(mén)降解DNA，促使細(xì)胞凋亡。相關(guān)研究指出，耐藥細(xì)胞系A(chǔ)549/cDDP細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度與敏感細(xì)胞系A(chǔ)549相比相對(duì)較低，TOR對(duì)于Ca2+具有雙向調(diào)節(jié)的作用，高濃度的TOR可以促進(jìn)Ca2+濃度的上升，促使細(xì)胞出現(xiàn)死亡。本研究說(shuō)明，治療時(shí)使用5 μmol/L劑量可以達(dá)到化療增敏和逆轉(zhuǎn)作用，降低大計(jì)量應(yīng)用導(dǎo)致的毒副作用，對(duì)于臨床用藥有一定的指導(dǎo)意義。

綜上，TOR聯(lián)合cDDP應(yīng)用時(shí)，可以有效提升A549/cDDP的轉(zhuǎn)錄和治療效果，避免了大劑量使用可能帶來(lái)的毒副作用。