OPN和VEGF的表達(dá)在老年乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中的意義

劉偉 陳宗義 劉道生 洪偉 楊德盛 陳佳

(1遵義市第一人民醫(yī)院 遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院，貴州 遵義 563000；2遵義市紅花崗區(qū)人民醫(yī)院；3秦皇島市中醫(yī)醫(yī)院 河北中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

乳腺癌好發(fā)于老年女性，發(fā)病率呈不斷上漲趨勢(shì)，具有較高死亡率，嚴(yán)重影響老年女性的身心健康及生命安全〔1〕。早期發(fā)現(xiàn)、診斷、治療乳腺癌是提高生存率的關(guān)鍵。目前臨床治療乳腺癌雖然以綜合治療為主，但手術(shù)治療仍不能忽視，且手術(shù)可有效清除病灶，對(duì)于手術(shù)患者進(jìn)行定期隨訪、監(jiān)測(cè)仍至關(guān)重要，可為復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的防治提供重要依據(jù)〔2〕。近年來，臨床對(duì)乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的檢測(cè)方法較多，不少學(xué)者認(rèn)識(shí)到，腫瘤的發(fā)生是多基因參與及多步驟發(fā)生的過程，腫瘤標(biāo)志物可能與乳腺癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移具有密切關(guān)系。近期有學(xué)者發(fā)現(xiàn)骨橋蛋白(OPN)在乳腺癌的發(fā)展過程中起到十分重要作用，但關(guān)于此項(xiàng)研究仍在初步階段〔3〕。此外，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是腫瘤生成過程中特異性最高的促血管生長因子，對(duì)腫瘤血管的生成起到重要誘導(dǎo)作用〔4〕。目前臨床常常將OPN、VEGF關(guān)系應(yīng)用在肝癌、肺癌研究中，對(duì)乳腺癌的研究尚不多見，尤其是其聯(lián)合表達(dá)在乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中的意義。本研究旨在探討OPN、VEGF表達(dá)在老年乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中的意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性收集2009年1月至2014年12月在遵義市第一人民醫(yī)院行乳腺癌手術(shù)且獲得隨訪的62例乳腺癌患者臨床資料，根據(jù)5年內(nèi)是否發(fā)生復(fù)發(fā)，將其分為5年內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組37例(A組)及無瘤生存5年及以上組25例(B組)。另收集2015年1月至2019年1月期間遵義市第一人民醫(yī)院接收的正常乳腺組織(良性腫瘤旁組織)15例患者臨床資料，將其設(shè)為C組。患者均為女性，年齡60～75歲，平均(68.56±5.32)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者符合《中國抗癌協(xié)會(huì)乳腺癌診治指南與規(guī)范》〔5〕中診斷標(biāo)準(zhǔn)；②入院之前未進(jìn)行放化療等相關(guān)治療。③年齡60～75歲；④所有患者臨床資料完整且影像學(xué)資料清晰；⑤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移時(shí)進(jìn)行活檢經(jīng)病理證實(shí)為乳腺癌復(fù)發(fā)或者轉(zhuǎn)移。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重心、肝、腎等重要臟器病變者；②合并其他惡性腫瘤者；③合并感染性疾病或免疫系統(tǒng)疾病；④精神疾病患者或認(rèn)知功能障礙者。3組一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 3組一般資料對(duì)比

1.2方法

1.2.1檢測(cè)血清中OPN和VEGF水平 采集所有患者當(dāng)日清晨空腹靜脈血5 ml，2 500 r/min離心15 min，取上清液，放置在-20℃的冰箱中保存待檢，血清中OPN(美國R&D公司提供試劑盒)、VEGF水平(上海西塘生物科技有限公司提供試劑盒)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定。不同水平檢測(cè)均嚴(yán)格按照各自試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.2檢測(cè)病理組織中OPN和VEGF表達(dá) 儀器：北京中杉金橋生物科技有限公司提供的ZM-0174型兔抗人OPN多克隆抗體；兔抗人VEGF單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司，BA0407)；試劑：武漢博士德生物工程有限公司提供的SP-9001型免疫組織化學(xué)染色試劑盒；北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供的二氨基聯(lián)苯胺染色試劑；上海之信儀器有限公司提供的YD-1508R石蠟切片機(jī)；光學(xué)顯微鏡(南京江南光電集團(tuán)股份有限公司，XS-200)。病理組織中的OPN、VEGF表達(dá)通過免疫組織化學(xué)法檢測(cè)，取組織標(biāo)本，通過甲醛溶液進(jìn)行固定，對(duì)其進(jìn)行脫水，透明1 min(二甲苯中)，給予常規(guī)包埋；對(duì)石蠟標(biāo)本連續(xù)切片(厚4 μm)；對(duì)其進(jìn)行脫蠟及水化；并放入到磷酸鹽緩沖液(PBS)中沖洗3次，3 min/次；通過在乙二胺四乙酸95℃下進(jìn)行修復(fù)抗原15 min，使得抗原充分暴露；置于3% H2O2室溫下孵育10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性；滴加封閉用正常山羊血清工作液15 min，以減少組織中非特異性染色，傾去余液；加入一抗工作液(OPN、VEGF的濃度分別為1∶100、1∶150)，置于4℃冰箱濕盒內(nèi)過夜，PBS沖洗3次，3 min/次；滴加生物素化二抗工作液，在37℃下孵育10 min，PBS沖洗3次，3 min/次；再次進(jìn)行滴加SP試劑，并孵育15 min，采用PBS進(jìn)行沖洗，3次，3 min/次；并通過二氨基聯(lián)苯胺顯色10 min，用蒸餾水進(jìn)行沖洗，通過蘇木精進(jìn)行復(fù)染，給予常規(guī)脫水、透明及封片等處理；在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照。

1.3OPN和VEGF免疫組織化學(xué)評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)〔6〕評(píng)估方法為雙盲法，當(dāng)結(jié)果不一致時(shí)，可由2名以上的高資歷醫(yī)師共同商討，最終確定結(jié)果。OPN染色主要定位在腫瘤細(xì)胞質(zhì)，呈現(xiàn)棕黃色、彌漫狀、間質(zhì)少有染色；VEGF染色主要定位在癌細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色，彌漫狀，間質(zhì)少有染色。在高倍顯微鏡下(×400)，采用隨機(jī)方式選擇5個(gè)視野，200個(gè)腫瘤細(xì)胞/視野，將陽性細(xì)胞所占的比例計(jì)為a，染色強(qiáng)度計(jì)為b，根據(jù)a和b兩方面進(jìn)行分別計(jì)分，將a與b的乘積進(jìn)行半定量分析。其中a計(jì)分如下：0分：無陽性細(xì)胞、1分：1%～10%、2分：11%～25%、3分：26%～50%、4分：51%～75%、5分：≥76%；b計(jì)分如下：0分：無著色、1分：淡黃色或黃色、2分：棕黃色、3分：棕褐色。以a與b的乘積作為最終得分，其中分?jǐn)?shù)>3分為陽性，≤3分為陰性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，t檢驗(yàn)；繪制受試者工作特征(ROC)曲線并計(jì)算曲線下面積(AUC)值。

2 結(jié) 果

2.1血清中OPN和VEGF水平對(duì)比 A組血清中OPN、VEGF水平明顯高于B、C組，B組血清中OPN、VEGF水平明顯高于C組(均P<0.05)。見表2。

表2 3組血清中OPN和VEGF水平對(duì)比

2.23組病理組織中OPN和VEGF陽性表達(dá)比較 A組OPN、VEGF陽性表達(dá)率均明顯高于B組、C組，且B組OPN、VEGF陽性表達(dá)率均明顯高于C組(P<0.05)。見表3。

表3 3組病理組織中OPN和VEGF陽性表達(dá)率比較〔n(%)〕

2.3血清OPN和VEGF水平用于預(yù)測(cè)乳腺癌患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的價(jià)值分析 血清OPN、VEGF用于預(yù)測(cè)乳腺癌患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的AUC分別為0.723、0.707，預(yù)測(cè)價(jià)值好。見表4，見圖1。

表4 血清OPN和VEGF水平用于預(yù)測(cè)乳腺癌患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的價(jià)值

圖1 血清中OPN、VEGF預(yù)測(cè)乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的ROC曲線

2.4病理組織中OPN和VEGF陽性表達(dá)用于預(yù)測(cè)乳腺癌患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的價(jià)值分析 病理組織中OPN和VEGF陽性表達(dá)用于預(yù)測(cè)乳腺癌患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的曲線下面積分別為0.711、0.706，預(yù)測(cè)價(jià)值好。見表5，見圖2。

表5 病理組織中OPN和VEGF陽性表達(dá)用于預(yù)測(cè)乳腺癌患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的價(jià)值

圖2 病理組織中OPN、VEGF表達(dá)預(yù)測(cè)乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的ROC曲線

3 討 論

乳腺癌發(fā)病率位居女性惡性腫瘤第一位〔7〕。該病多發(fā)于中老年女性群體，乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移是造成患者死亡的重要原因之一，可見，給予乳腺癌患者早期科學(xué)有效的診斷，對(duì)降低術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，提高生存率具有十分重要的作用。學(xué)者認(rèn)為〔8〕年齡、病理分期、組織學(xué)分級(jí)、手術(shù)方式等因素與乳腺癌患者的預(yù)后具有重要關(guān)系，但在臨床上醫(yī)師常發(fā)現(xiàn)，患者年齡、分期及病理類型等情況基本相近的乳腺癌患者，其預(yù)后也不盡相同，分析其原因在于，惡性腫瘤的發(fā)展受到多基因、多步驟等影響，故尋求更多影響乳腺癌患者預(yù)后的因素，成為臨床目前研究的重點(diǎn)，這對(duì)提高無瘤生存率起到至關(guān)重要的作用。最近研究發(fā)現(xiàn)OPN是一種帶負(fù)電荷且具有親水性的糖蛋白，其可通過巨噬細(xì)胞、骨細(xì)胞等多種腫瘤細(xì)胞分泌，參與多種病理生理過程，且在乳腺癌發(fā)展過程中起到重要作用，但是OPN與VEGF聯(lián)合及單獨(dú)表達(dá)與乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)性類研究仍處于初涉階段〔9，10〕。

OPN基因的表達(dá)具有組織細(xì)胞特異性，受到多種生長因子、激素等的調(diào)控，在特定病理?xiàng)l件下，OPN能夠與多種整合素受體及CD44相互結(jié)合，不僅能夠促進(jìn)腫瘤血管形成，也可使得腫瘤細(xì)胞發(fā)生增殖、侵襲，對(duì)抑制細(xì)胞凋亡等起到十分重要的作用〔11，12〕。近年來，有研究顯示，乳腺癌發(fā)生受到OPN表達(dá)的影響，其在乳腺癌的發(fā)展、病變過程中起到至關(guān)重要的作用，臨床可通過檢測(cè)OPN水平，判斷患者預(yù)后〔13〕。本研究結(jié)果表明OPN在乳腺癌組織中具有較高表達(dá)，可評(píng)價(jià)乳腺癌患者復(fù)發(fā)情況。很多學(xué)者與本實(shí)驗(yàn)具有相似的結(jié)論，高金亮等〔14〕研究認(rèn)為OPN對(duì)評(píng)估乳腺癌生物學(xué)行為及患者預(yù)后具有一定的價(jià)值，OPN的表達(dá)強(qiáng)弱與乳腺癌惡性程度具有密切關(guān)系，正?；颊逴PN值為14～46 μg/L，若與該值差異較大，則提示乳腺癌已發(fā)生轉(zhuǎn)移。VEGF是一種可以由多種細(xì)胞分泌的糖蛋白，具有較高的血管滲透性，VEGF為腫瘤細(xì)胞的生長、新生毛細(xì)血管網(wǎng)的建立提供十分重要的營養(yǎng)基礎(chǔ)；此外，VEGF也是一種具有高度特異性的血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原，對(duì)腫瘤細(xì)胞的快速生長具有一定促進(jìn)作用〔15，16〕。本研究結(jié)果可見VEGF對(duì)乳腺癌的預(yù)后具有顯著影響，可評(píng)價(jià)乳腺癌復(fù)發(fā)情況。分析其原因在于，VEGF是重要的血管內(nèi)皮生長因子，具有較高特異性，在腫瘤血管生成中起到重要作用，可誘導(dǎo)腫瘤血管生成，而乳腺癌的生長、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移是依賴血管生成〔17，18〕。繪制ROC曲線結(jié)果顯示，血清、病理組織中OPN和VEGF用于預(yù)測(cè)乳腺癌患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)價(jià)值好。