不同類型標(biāo)本新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)核酸檢測(cè)結(jié)果比較

戎庭軍，李雄偉，胡文壇，匡一鳴

(信陽(yáng)市中心醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，河南 信陽(yáng) 464000)

2019年12月，我國(guó)湖北省武漢市暴發(fā)新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease 2019，COVID-19)，截止2020年3月1日，中國(guó)已累計(jì)報(bào)告確診病例80 026例，累計(jì)死亡2 912例[1]；中國(guó)境外共58個(gè)國(guó)家累計(jì)確診7 169例，死亡104例。SARS-CoV-2屬于β屬的冠狀病毒，為單鏈正義RNA病毒，主要通過(guò)呼吸道的飛沫和接觸傳播，通常在人類和動(dòng)物中引起呼吸、消化和神經(jīng)系統(tǒng)疾病[2-3]。冠狀病毒曾引起了2次全球性傳播的嚴(yán)重呼吸道傳染病，其中1次是2003年在中國(guó)廣東省發(fā)生的嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)，俗稱非典型性肺炎[4-5]，另一起是2012年在沙特阿拉伯暴發(fā)的中東呼吸綜合征(Middle East respiratory syndrome，MERS)[6]。但是SARS-CoV-2基因特征與SARS-CoV和MERS-CoV有區(qū)別，目前的研究顯示SARS-CoV-2與蝙蝠SARS樣冠狀病毒(bat-SL-CoVZC45)的同源性達(dá)85%以上[7]。

對(duì)于疑似新型冠狀病毒感染患者的確診，除了有病毒性肺炎的流行病學(xué)史、臨床癥狀和影像學(xué)特征外，SARS-CoV-2核酸陽(yáng)性結(jié)果是確診的“金標(biāo)準(zhǔn)”[8]。然而對(duì)于呼吸道疾病病毒核酸檢測(cè)，標(biāo)本質(zhì)量直接影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。目前，臨床提供用于SARS-CoV-2核酸檢測(cè)的標(biāo)本多種多樣，常見(jiàn)的標(biāo)本如呼吸道分泌物和支氣管、肺泡灌洗液等，另外也有報(bào)道表明部分患者的糞便中也檢測(cè)出SARS-CoV-2[9]，但是無(wú)論用哪種類型的標(biāo)本進(jìn)行SARS-CoV-2檢測(cè)均有一定的假陰性率。因此，闡明不同類型標(biāo)本SARS-CoV-2陽(yáng)性檢出率對(duì)SARS-CoV-2檢測(cè)工作及COVID-19患者的確診和治療效果評(píng)價(jià)尤為重要。本文采用回顧性研究方法，收集了2020年2月1日至2020年3月1日在信陽(yáng)市中心醫(yī)院確診和治療的新型冠狀病毒患者的咽拭子、痰液和糞便標(biāo)本，采用熒光定量PCR法分別進(jìn)行SARS-CoV-2核酸檢測(cè)，以獲得不同類型標(biāo)本的SARS-CoV-2核酸陽(yáng)性檢出率，為SARS-CoV-2的檢測(cè)工作、COVID-19患者的診斷和治療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料回顧性收集2020年2月1日至2020年3月1日在信陽(yáng)市中心醫(yī)院就診治療的COVID-19患者26例，由臨床醫(yī)護(hù)人員分別采集咽拭子、痰液和糞便標(biāo)本保存在含有病毒保存液的樣本保存管內(nèi)，及時(shí)送至檢驗(yàn)科PCR實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行SARS-CoV-2核酸檢測(cè)。

1.2 試劑與儀器SARS-CoV-2核酸檢測(cè)提取和測(cè)試劑盒(熒光PCR法)來(lái)自上海捷諾生物技術(shù)股份有限公司，ABI7500型熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司，生物安全柜購(gòu)自山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司，恒溫金屬浴購(gòu)自杭州博日科技有限公司，高速離心機(jī)購(gòu)自湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3 SARS-CoV-2核酸檢測(cè)按照SARS-CoV-2核酸提取試劑說(shuō)明，向痰液標(biāo)本中加入等體積乙酰半胱氨酸溶液(10 g·L-1)，混勻，室溫靜置30 min，再將保存于病毒保存液的咽拭子標(biāo)本和糞便標(biāo)本分別用一次性吸管吹打7～8次，室溫靜置5 min。所有標(biāo)本1 000 r·min-1離心5 min，取上清液200 μL放置于1.5 mL EP管中，再加入600 μL病毒裂解液，震蕩混勻，室溫靜置10 min，加入800 μL的上柱結(jié)合液并混勻；將混合液分2次轉(zhuǎn)入到核酸提取柱內(nèi)并16 000 r·min-1離心1 min，棄掉收集管中液體；向離心柱內(nèi)加入700 μL清洗液，16 000 r·min-1離心1 min，棄掉收集管中液體；再向離心柱內(nèi)加入300 μL清洗液，16 000 r·min-1離心1 min，棄掉收集管中液體，再16 000 r·min-1離心2 min；將離心柱放入新的收集管內(nèi)，加入50 μL的洗脫液，室溫靜置2 min，16 000 r·min-1離心2 min，收集管中RNA溶液用于熒光定量PCR檢測(cè)。按照1份反應(yīng)體系13 μL PCR混合液和5 μL PCR酶溶液的比例配制PCR反應(yīng)液，每孔18 μL分裝到八連管中，再分別加入2 μL提取的RNA溶液，然后上機(jī)檢測(cè)。PCR擴(kuò)增程序：第1步反轉(zhuǎn)錄，42 ℃ 5 min，1個(gè)循環(huán)；第2步預(yù)變性，95 ℃ 3 min；第3步循環(huán)擴(kuò)增，95 ℃ 10 s，60 ℃ 31 s，40個(gè)循環(huán)，在58 ℃檢測(cè)熒光信號(hào)。檢測(cè)SARS-CoV-2基因組中的開(kāi)放讀碼框1ab(open reading frame 1ab，ORF1ab)及編碼核衣殼蛋白(nucleocapsid protein，N)基因，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)提供的結(jié)果解釋，CT值小于37判定為陽(yáng)性，CT值大于40或無(wú)判定為陰性，CT值在37和40之間需要復(fù)查，以1份樣本中ORF1ab和N基因雙陽(yáng)性或2次采樣ORF1ab基因均陽(yáng)性判定為SARS-CoV-2陽(yáng)性，否則判定為SARS-CoV-2陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)與分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料用中位數(shù)表示，計(jì)數(shù)資料用百分比表示，3組間陽(yáng)性檢出率比較采用Cochran’sQ檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

26例患者中，男12例，女14例，年齡27～73歲，中位年齡47.5歲。在26例患者的咽拭子標(biāo)本中，檢測(cè)出SARS-CoV-2核酸陽(yáng)性的為18例，陽(yáng)性率為69.23%；痰液標(biāo)本中檢測(cè)出SARS-CoV-2核酸陽(yáng)性的為25例，陽(yáng)性率為96.15%；糞便標(biāo)本中檢測(cè)SARS-CoV-2核酸陽(yáng)性為2例，陽(yáng)性率為7.69%。2例糞便標(biāo)本陽(yáng)性的患者咽拭子與痰液標(biāo)本結(jié)果也均為陽(yáng)性；1例痰液標(biāo)本陰性的患者其咽拭子結(jié)果為陽(yáng)性，糞便標(biāo)本結(jié)果為陰性；8例患者痰液標(biāo)本為陽(yáng)性，咽拭子和糞便標(biāo)本結(jié)果均為陰性，15例患者糞便標(biāo)本結(jié)果為陰性，痰液和咽拭子標(biāo)本均為陽(yáng)性，具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，痰液標(biāo)本陽(yáng)性率最高(96.15%)，咽拭子標(biāo)本陽(yáng)性率次之(69.23%)，糞便標(biāo)本中陽(yáng)性率最低(7.69%)。痰液標(biāo)本SARS-CoV-2核酸陽(yáng)性檢出率高于咽拭子和糞便標(biāo)本陽(yáng)性檢出率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

表1 26例患者一般資料及核酸結(jié)果

3 討論

目前對(duì)于疑似COVID-19患者主要是取咽拭子標(biāo)本[10-11]，利用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行SARS-CoV-2核酸檢測(cè)；然而許多患者確診需要多次咽拭子標(biāo)本核酸檢測(cè)，甚至造成漏診，其中咽拭子采集者的操作水平、檢驗(yàn)試劑、檢驗(yàn)人員水平、標(biāo)本的運(yùn)輸保存等均對(duì)結(jié)果造成影響，但是對(duì)于標(biāo)本類型的選擇影響不可不考慮。本研究主要目的是利用熒光PCR技術(shù)比較同一患者不同標(biāo)本中SARS-CoV-2核酸檢出率，所有納入研究的病例均為確診病例。本研究結(jié)果表明，26例COVID-19患者的不同類型標(biāo)本中，痰液標(biāo)本SARS-CoV-2核酸陽(yáng)性檢出率最高，為96.23%，咽拭子標(biāo)本核酸陽(yáng)性檢出率為69.23%，糞便標(biāo)本陽(yáng)性率檢出率最低，僅為7.69%。這表明對(duì)SARS-CoV-2核酸進(jìn)行檢測(cè)，痰液標(biāo)本陽(yáng)性率明顯高于咽拭子和糞便標(biāo)本的陽(yáng)性率。

SARS-CoV-2在痰液標(biāo)本中陽(yáng)性檢出率更高，一方面可能是因?yàn)榕R床咽拭子采集的不規(guī)范、不標(biāo)準(zhǔn)，另一方面也可能因?yàn)樵摬《局饕忠u和感染下呼吸道細(xì)胞，病毒在下呼吸道的水平遠(yuǎn)高于上呼吸道，且當(dāng)患者體內(nèi)病毒水平較低時(shí)，咽拭子標(biāo)本很難采集到足夠的病毒。因此，在診斷疑似患者和評(píng)估確診患者治療效果時(shí)，下呼吸道標(biāo)本中痰液較咽拭子和糞便更加適合于病毒核酸檢測(cè)。

本研究仍有許多局限性：首先，納入研究的確診患者只有26例，下一步需要更多的數(shù)據(jù)來(lái)進(jìn)行更深入的研究；其次，僅研究了痰液、咽拭子和糞便3種類型標(biāo)本的病毒核酸陽(yáng)性檢出率，沒(méi)有對(duì)血清、血漿、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液、尿液等標(biāo)本進(jìn)行研究；最后，雖然痰液標(biāo)本的病毒核酸陽(yáng)性檢出率最高，但是部分確診患者并不產(chǎn)生痰液，這將導(dǎo)致痰液標(biāo)本的采集十分困難。

總之，在利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)SARS-CoV-2核酸時(shí)，痰液標(biāo)本陽(yáng)性檢出率明顯高于咽拭子和糞便標(biāo)本。建議對(duì)疑似COVID-19患者，首先應(yīng)該采集痰液標(biāo)本進(jìn)行SARS-CoV-2核酸檢測(cè)，如無(wú)法采集到痰液，才可選擇咽拭子標(biāo)本，這將有利于疑似患者的確診，提高臨床診斷的準(zhǔn)確性。