硫化氫熒光探針的研究進展*

周學文，吳莎莎，李向華，黃勝堂，王小波

(湖北科技學院藥學院，湖北 咸寧 437100)

硫化氫(H2S)是人體內(nèi)繼NO和CO之后發(fā)現(xiàn)的第三種內(nèi)源性氣體信號分子。它主要由L-半胱氨酸通過酶解反應產(chǎn)生，這些酶包括胱硫醚-β-合成酶(CBS)、胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)、3-巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶(3-MST)和半胱氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(CAT)[1]。H2S生理濃度介于1nmol與1mmol之間不等，它參與一系列生理調(diào)控活動，如調(diào)節(jié)血管舒張、神經(jīng)傳導、心肌收縮、細胞凋亡、炎癥、缺血再灌注損傷及胰島素分泌等[2]。H2S因具有還原性而常作為體內(nèi)活性氧(ROS)和活性氮(RNS)的清道夫，細胞一旦無法維持正常的H2S濃度，則可能會導致阿爾茲海默式癥、唐氏綜合征、胃黏膜損傷、高血壓和肝硬化等疾病[3]。

目前，用來檢測體內(nèi)(血漿或勻漿組織)H2S的方法有比色法、電化學分析法、色譜分析法和金屬硫化物沉淀法等[4-7]，而這些方法有一個共性的弊端，即通常需要對實驗對象進行預處理，如組織勻漿和細胞破碎。近年來興起的熒光探針檢測法能很好地克服上述方法的不足而實現(xiàn)原位檢測；同時，熒光分析本身具有很高的靈敏度，理論上可以達到單分子檢測水平?；诖?，近年來關于H2S的熒光小分子探針備受青睞，且涌現(xiàn)出一系列豐碩的成果[8-10]。根據(jù)H2S的化學特性，在設計H2S熒光探針時常采取的策略有三種[11-12]：①H2S還原疊氮/硝基為氨基；②H2S的一步或兩步親核取代反應；③生成金屬硫化物。見圖1(封三)。下面將通過上述三種傳感H2S機理的不同分別對小分子H2S熒光探針進行綜述。

1 基于還原反應的H2S熒光探針

H2S具有較強的還原性，在一定條件下可與疊氮、羥胺或硝基發(fā)生還原反應而生成氨基取代物。由于反應前后的取代基有著較明顯的吸電子能力差異，因而可通過選擇和調(diào)節(jié)熒光團上的取代基的給電子/吸電子能力，來改變探針的電子密度(或分布)及電子遷移，進而實現(xiàn)所設計小分子的熒光強弱變化、發(fā)射波長的紅移或藍移等，并由此誕生了諸多基于還原反應的H2S熒光探針。

Lippert等[13]以羅丹明作為熒光團和疊氮基為反應基團制備得到了兩個H2S熒光探針1與2(圖2)。分子結構中閉合環(huán)狀的內(nèi)酯結構使得1和2本身沒有熒光，而當向它們的溶液中加入H2S后，-N3被H2S選擇性地還原為-NH2，同時內(nèi)酯結構開環(huán)而產(chǎn)生明顯的熒光(λem=525nm)。競爭性實驗表明，ROS與RNS如H2O2、tBuOOH、ClO-、NO2-、NO、O2-、GSH、Cys、S2O3-、硫辛酸等均不影響對H2S的檢測，表現(xiàn)出對H2S較高的選擇性和靈敏性，成功實現(xiàn)了在HEK293T細胞和其它哺乳動物細胞中對外源性H2S的熒光檢測。上述兩個探針的不足在于檢測限與響應時間，于是Lippert[14]對探針進行了進一步優(yōu)化，得到了新的探針3～5(圖2)，提高了對H2S響應的靈敏度和特異性。重要突破是利用化合物5實現(xiàn)了對內(nèi)源性H2S的實時檢測，結果表明在血管內(nèi)皮細胞中，H2S的產(chǎn)生除依賴于胱硫醚γ-裂解酶(CSE)外，還與血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR2)密切相關。

圖2 探針1～5的結構

Sun等[15]開發(fā)了一種以苯并吡喃為母核，-N3為反應位點的近紅外雙光子H2S熒光探針6(圖3)。該探針對H2S表現(xiàn)出很高的選擇性，其它RSS與ROS均對檢測無影響，對H2S的檢測限達3.5μM(λex=520nm，λem=670nm)，利用6成功檢測了商業(yè)胎牛血清(FBS)中的H2S含量。此外，在雙光子熒光顯微鏡輔助下，該探針還可用于對MCF-7細胞和深層組織(小鼠肝癌組織切片)中的熒光成像。更為重要的是依靠探針6，人們首次實現(xiàn)了小鼠活體內(nèi)的H2S熒光造影。

王瑩等[16]利用氨基苯基花色素染料在長波長區(qū)域的強發(fā)光特性，設計合成了一個以-N3為活性位點的H2S熒光探針7(圖3)。在530nm激發(fā)波長下，此探針在600～700nm范圍內(nèi)能高選擇性、高靈敏性地檢測H2S，同時在0～60μM濃度區(qū)間內(nèi)線性關系良好，靈敏度達7.65×10-8M。由于7對H2S的檢測波長達到了630nm，位于紅光區(qū)，具有避免生物分子自發(fā)熒光干擾和組織穿透性高的特點，該探針成功用于HeLa細胞中外源性H2S的熒光成像。

與探針7思路類似，Chen等[17]同樣以花色素型陽離子衍生物為熒光團，改之亞硝基為識別位點設計合成了一個高效的“OFF-ON”型H2S熒光探針8(圖3)。向8中加入H2S時，亞硝基迅速被還原為氨基而在625nm處產(chǎn)生強烈的熒光(λex=570nm)。在0～4μM濃度區(qū)間內(nèi)，熒光強度與NaHS的濃度具有良好的線性關系，并由此可得出其對H2S的檢測限為29nM。該探針也成功用于SMMC-7721細胞中H2S的熒光成像。

2 基于親核反應的H2S熒光探針

在生理條件下，H2S的主要存在形式為HS-，其親核性比Cl-、OH-等常見陰離子強許多。就pKa而言，H2S約為7.0，而其它代表性巰基化合物如GSH、Cys的則為7.0～8.5，表明在生理環(huán)境中H2S比GSH、Cys等具有更強的親核性。因此，利用H2S的強親核性，可將HS-與其它陰離子或巰基化合物區(qū)分開。該類型的熒光探針又可細分為兩類：①發(fā)生一次親核取代反應；②發(fā)生兩次親核取代反應。Li等[18]以花青素染料為熒光團，利用H2S對Cl的親核取代反應而制備了分子9(圖3)。該分子在近紅外區(qū)對H2S表現(xiàn)出優(yōu)異的比例型光聲信號響應，隨著H2S對Cl的取代，800nm處的光聲信號逐漸衰減，而720nm處則逐漸增強。探針9成功用于小鼠體內(nèi)，對H2S的光聲成像具有高保真和快速清除的效果。

圖3 探針6～11的結構

Li等[19]設計并合成了兩個雙光子H2S熒光探針10與11(圖3)，它們均對H2S有很好的選擇性和靈敏性，在Tris-HCl緩沖溶液中的檢測響應時間快至50s。探針10的檢測機理為：在H2S的介導下，10發(fā)生串聯(lián)二硫化物交換，隨后歷經(jīng)親核取代-環(huán)化反應，最后熒光得以增強。而11的熒光團(1，8-萘二酰亞胺)由于是通過酰胺鍵連接，加入H2S后導致熒光呈“OFF”狀態(tài)，所以無法驗證其雙親核取代反應歷程。進一步地，探針11成功用于對MCF-7細胞中H2S的熒光成像。探針10通過與細胞器特異性染料共定位實驗，表明其能靶向溶酶體(重疊率達0.94)。

3 基于CuS生成的H2S熒光探針

以識別基團結合Cu2+后，通常由于Cu2+的順磁性會導致熒光小分子的熒光發(fā)生淬滅。而S2-有很高的親和力，其Ka值達10-36。向體系中加入H2S后，電離平衡產(chǎn)生的S2-與Cu2+迅速結合形成CuS沉淀，于是熒光分子的熒光重新恢復。

基于上述原理，Sasakura等[20]選取熒光素為熒光團，以酰胺鍵分別連接cyclen、cyclam及tacn，并利用Cu2+為配位金屬離子制備得到了4個熒光素-大環(huán)多胺-Cu(П)配合物12～15(圖4)。其中13對H2S表現(xiàn)出高選擇性和高靈敏性，ROS與其它RNS無響應，且由于其高穩(wěn)定性，高濃度的GSH也不影響H2S的檢測。由于激發(fā)波長在可見光區(qū)，通過以不同濃度的H2S孵育HeLa細胞，并對比20min后細胞內(nèi)平均熒光強度，發(fā)現(xiàn)FI20min/FI0min隨Na2S孵育濃度增加而增大。除此之外，13還可廣泛用于檢測各種酶反應體系中的H2S，如3-巰基丙酮酸轉(zhuǎn)硫酶(3MST)，或來自3MST表達細胞的溶菌液及3-巰基丙酮酸等。該探針在胱硫醚β-合成酶(CBS)、CSE與3MST等的激動劑與拮抗劑的高通量篩選領域頗具潛力，并期待在深入探索H2S的生理功能方面發(fā)揮重要應用。

Palanisamy等[21]以cyclen為Cu2+為金屬中心，蒽環(huán)為熒光團，制備了一個H2S熒光探針16(圖4)。當加入NaHS后，CuS沉淀的生成使熒光得以恢復。16對H2S除了優(yōu)良的選擇性，還有另外的優(yōu)點，如較快的響應速度(小于1min)，低的檢測限(205nM)及良好的可逆性等，最終該探針成功用于HeLa細胞及斑馬魚中對H2S的熒光成像。

圖4 探針12～16的結構

4 總 結

作為氣體信號分子之一的H2S在各項生理活動中均有其身影，雖然對它的研究在逐步深入，但同時也距離揭開其“神秘面紗”還為時尚早。H2S的重要性除了在生命科學，還將體現(xiàn)在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)和環(huán)境等各個方面。要想徹底了解H2S的產(chǎn)生、代謝、功能、信號調(diào)節(jié)等各個環(huán)節(jié)，必然迫切需要對它的高靈敏度和低成本的高效檢測手段，因而，開發(fā)和探索針對H2S的小分子熒光探針將持續(xù)受到化學、生命科學和醫(yī)學領域的研究者的青睞。本論文僅限對當前有代表性的H2S熒光探針做個小結(見表1)，隨著新型熒光探針理念的發(fā)展完善和熒光檢測技術的升級，對H2S生理功能的全面揭示將指日可待。

表1 本文列舉的H2S熒光探針總結