大黃素聚乳酸微球的制備及體外釋藥行為研究*

李鳴粵，趙志偉，羅斌華**

(1.湖北科技學(xué)院藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100；2.咸寧市中心醫(yī)院/湖北科技學(xué)院第一附屬醫(yī)院影像科)

大黃素(1，3，8-三羥基-6-甲基蒽醌)為大黃眾多生物活性成分中的蒽醌類(lèi)單體化合物，多存在于大黃、何首烏等蓼科植物中，來(lái)源分布廣泛。大黃素藥理學(xué)活性多樣，臨床應(yīng)用價(jià)值較高，目前對(duì)其藥理作用機(jī)制研究較多，發(fā)現(xiàn)其具有抗炎、抗腫瘤、治療糖尿病并發(fā)癥等生物藥理活性[1-4]。聚乳酸(polylactic acid，PLA)是一種具有廣泛應(yīng)用前景的脂肪族聚酯類(lèi)高分子材料，由于其優(yōu)良的生物相容性、生物降解性、力學(xué)性能等特性，吸引眾多研究者對(duì)其進(jìn)行各方面的深入研究[5-6]。由于PLA中存在α-甲基，使其機(jī)械性質(zhì)和理化性質(zhì)更為多樣[7]。相關(guān)研究證實(shí)PLA及其共聚物構(gòu)建的微球，其粒徑、形態(tài)、結(jié)構(gòu)和分子量等物理化學(xué)特性較好，是理想的藥物載體[8-10]。

本文以PLA為藥物載體材料，大黃素為模型藥物，采用復(fù)乳溶劑揮發(fā)法制備包裹大黃素的PLA微球(以下簡(jiǎn)稱(chēng)大黃素微球)，并對(duì)微球的形態(tài)、粒徑、載藥量與包封率進(jìn)行評(píng)價(jià)，通過(guò)透析袋法考察微球的體外釋藥行為，該研究將為大黃素緩釋制劑提供前期理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

大黃素(Aladdin，批號(hào)C1823172，含量 90%，HPLC)；十二烷基硫酸鈉(SDS，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20181210，含量 86%，化學(xué)純)；二氯甲烷(國(guó)藥集團(tuán)集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20160118，含量 99.5%，分析純)；司盤(pán)80(天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)20160113，分析純)；PLA(實(shí)驗(yàn)室自制，分子量10000)；透析袋(Bio sharp 36mmMW，14000)。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2004分析電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)，ZNCL-TS50ML恒溫磁力攪拌器(上海越眾儀器設(shè)備有限公司)，LDZ4-0.8低速自動(dòng)平衡離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)，SA3000生物顯微鏡(北京泰克儀器有限公司)，ZD-85恒溫振蕩器(國(guó)華企業(yè))，VARIAN CARY 50 Conc紫外分光光度計(jì)(德國(guó)賀利氏)。

1.3 大黃素微球的制備

稱(chēng)取大黃素0.0200g置于西林瓶A，加入0.5mL NaOH溶液(0.5%)，震蕩充分溶解；PLA 0.1000g，二氯甲烷1.5mL，司盤(pán)80適量，加入西林瓶B內(nèi)，充分混勻；將A瓶藥液轉(zhuǎn)移至B瓶?jī)?nèi)，移液槍充分吹打均勻，鏡下觀察形成初乳。0.5%SDS溶液加入西林瓶C，將初乳加入西林瓶C內(nèi)，45rpm/min的速度攪拌1h，鏡下觀察形成微球，40℃下真空干燥。

1.4 大黃素微球體外分析方法的建立

1.4.1 檢測(cè)條件

采用紫外分光光度法測(cè)定大黃素的濃度，溶解介質(zhì)為3%SDS的PBS緩沖液，室溫條件下，紫外分光光度計(jì)的檢測(cè)波長(zhǎng)為257nm。

1.4.2 大黃素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備

精密稱(chēng)取大黃素0.0117g于25mL容量瓶中，用3%SDS的PBS緩沖液作為溶劑溶解(pH 7.4)并定容，作為儲(chǔ)備液。然后分別從儲(chǔ)備液中取0.5、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mL，定容至25mL，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。在紫外257nm處測(cè)定樣品吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度和吸光度進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得大黃素濃度的吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.5 大黃素微球中大黃素的載藥量和包封率測(cè)定

1.5.1 大黃素微球中大黃素載藥量測(cè)定

微球中的包載藥物量采用間接法測(cè)定。將制備的大黃素微球溶液在4000rpm的條件下離心10min，收集濾液和微球，微球真空干燥。濾液采用紫外分光光度法測(cè)定未包載的大黃素藥物濃度，計(jì)算大黃素量，微球中包載的大黃素質(zhì)量等于投藥量減去溶液中游離藥物，并通過(guò)以下公式求算載藥量(DL%)：DL%=微球中所含大黃素的重量/微球的總重量×100%。

1.5.2 大黃素微球中大黃素包封率測(cè)定

通過(guò)1.5.1方法，得到包載的藥物量，通過(guò)以下公式求算包封率(EE%)：EE%=W1/W(W1即已包裹的大黃素重量，W即大黃素的總重量)。

1.6 大黃素微球體外釋放實(shí)驗(yàn)

取適當(dāng)長(zhǎng)度透析袋，去離子水煮沸30min備用。采用3%SDS的PBS緩沖液(pH7.4)作為透析液，將干燥的微球轉(zhuǎn)移至透析袋內(nèi)，浸入裝有50mL釋放介質(zhì)的帶塞錐形瓶，恒溫箱溫度設(shè)置為37℃，100rpm的速度震蕩，分別于0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、48、72、96、108、120、132、144、156、168、180、192、204、216、228、240取樣3mL，取相同體積新的空白釋放介質(zhì)補(bǔ)足。采用紫外分光光度法，測(cè)定釋放介質(zhì)中大黃素的濃度，通過(guò)大黃素濃度的吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，計(jì)算大黃素含量，最后求算累積釋放百分率。

2 結(jié) 果

2.1 大黃素微球制備

用生物顯微鏡對(duì)制備的大黃素微球進(jìn)行觀察分析，其平均粒徑為(4.87±0.1)μm。放置1、2、4、6和8d后的大黃素微球的水合粒徑變化如圖1所示。由圖可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，微粒的粒徑基本沒(méi)有變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明大黃素微球具有較好的穩(wěn)定性。

圖1 大黃素微球放置不同時(shí)間粒徑變化圖(n=3)

2.2 大黃素體外分析方法的建立

采用1.4.1的檢測(cè)條件進(jìn)樣分析，測(cè)定不同濃度大黃素的吸光度。對(duì)吸光度和大黃素的濃度(μg/mL)進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析，得回歸方程：y=0.032x+0.0003(R2=0.999)，說(shuō)明大黃素在9.36～29.95μg/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.3 微球載藥量與包封率

在大黃素和PLA不同比例(1∶1，1∶2，1∶3)制備的微球中，其中大黃素和PLA的比值為1∶2時(shí)，通過(guò)紫外分光光度計(jì)法計(jì)算大黃素的負(fù)載量為(31.37±1.41)%，包封率為(92.18±0.39)%，為最優(yōu)比例。

2.4 體外釋放度

如圖2所示，240h內(nèi)，大黃素微球中的大黃素的累積釋放量為(86.93±3.78)%。

圖2 大黃素微球中大黃素釋放曲線(xiàn)(n=3)

為了進(jìn)一步闡明大黃素微球的體外釋藥特性，在上述結(jié)果的基礎(chǔ)上對(duì)其體外釋藥曲線(xiàn)進(jìn)行擬合。分別采用Higuchi方程、Ritger-Peppas方程進(jìn)行模型擬合，計(jì)算R2作為模型擬合相似度的判據(jù)，結(jié)果如表1所示。R2越接近1，藥物釋放曲線(xiàn)與對(duì)應(yīng)方程的擬合效果越佳。從相關(guān)系數(shù)可知，大黃素微球釋藥曲線(xiàn)與Ritger-Peppas方程擬合度最好，其擬合方程為lnQ=0.3759lnt-2.0691(R2=0.959)。在Ritger-Peppas方程中，釋放指數(shù)N是表征釋放機(jī)制的特征參數(shù)，當(dāng)N>0.89時(shí)，為骨架溶蝕機(jī)制；當(dāng)0.45

表1 大黃素微球體外釋放性能擬合方程

3 討 論

本文以PLA為藥物載體材料，大黃素為模型藥物，采用復(fù)乳溶劑揮發(fā)法，構(gòu)建大黃素微球的給藥系統(tǒng)。最終制得的大黃素微球外形完整光滑，粒徑較均勻，微球藥物負(fù)載量可達(dá)(31.37±1.41)%，包封率為(92.18±0.39)%，目標(biāo)藥物負(fù)載量較高，并具有較好的穩(wěn)定性。微球制備過(guò)程中，影響微球粒徑的因素有攪拌速度、乳化劑濃度、初乳的粒徑大小等。為了制備符合要求的粒徑，在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，本實(shí)驗(yàn)控制了初乳的粒徑和后期的攪拌速度。初乳的粒徑主要控制內(nèi)水相和油相的體積，使其形成的初乳粒徑大小合適。后期復(fù)乳制備過(guò)程，通過(guò)調(diào)節(jié)攪拌速度，控制制備的復(fù)乳的粒徑，固化后，就形成粒徑適宜的微球。

大黃素通過(guò)紫外分光光度法測(cè)定其濃度，儀器靈敏度較高，線(xiàn)性關(guān)系和精密度良好，符合要求。通過(guò)透析袋法測(cè)定大黃素微球體外釋放度，釋放介質(zhì)選擇對(duì)大黃素有較好溶解的溶劑，發(fā)現(xiàn)載藥微球在漏槽條件下，0.5h釋藥量沒(méi)有超過(guò)30%，無(wú)明顯突釋效應(yīng)，240h內(nèi)累積釋放量為(86.93±3.78)%，結(jié)果表明大黃素微球能緩慢釋放藥物。進(jìn)一步通過(guò)對(duì)其體外釋藥曲線(xiàn)進(jìn)行擬合，從Ritger-Peppas方程擬合的結(jié)果來(lái)看，藥物的釋放符合Fick擴(kuò)散，證實(shí)其緩釋的效果較好。

本文只是研究了制備的大黃素微球的體外釋藥行為，后期可深入研究大黃素微球?qū)τ诩?xì)胞的毒性以及動(dòng)物體內(nèi)的釋藥行為，并研究其生物體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)，觀察將其制備成微球，能否提高大黃素的生物利用度，進(jìn)而評(píng)價(jià)大黃素微球的藥效學(xué)。