微管剪切蛋白Fidgetin在黑腹果蠅神經發(fā)育過程中的功能初探

王其霖，王珊，李港，毛傳樨，金珊

(湖北大學生命科學學院， 湖北 武漢 430062)

0 引言

微管是一種具有極性的細胞骨架，為長管狀的細胞器結構，在維持細胞形態(tài)、細胞分裂、信號轉導及物質輸送等過程中起著重要作用[1]. 微管是由α，β兩種類型的微管蛋白亞基形成的微管蛋白異二聚體和少量的微管結合蛋白(microtubule associated proteins，MAPs)聚合而成. 在微管動態(tài)變化過程中，有兩類蛋白參與微管組裝和解聚的動態(tài)調節(jié)[2]. 其中一類是微管穩(wěn)定因子，包括多種微管結合蛋白MAPs(如Tau、MAP 1和MAP 4)和微管末端協助微管聚合的因子(如EB 1和CLIP 170)等. 另一類是微管去組裝因子，參與微管剪切和末端解聚，如Fidgetin、Kinesin、Spastin及Katanin等. 某一蛋白的編碼基因發(fā)生突變時能夠導致某些遺傳性疾病的發(fā)生，如spastin突變時可以導致遺傳性痙攣性截癱[3]；TUBB3 (β-tubulin isotype III)突變可以導致嚴重的神經系統(tǒng)疾病TUBB綜合癥[4]；微管結合蛋白Tau的異常磷酸化可以導致阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease)[5].

Fidgetin是AAA(ATPase associated with various cellular activities)超家族成員之一，與Katanin及Spastin同屬于微管剪切蛋白[6].Fidgetin可以在紡錘體的負端剪切微管使其解聚而破壞微管的動態(tài)平衡[6]. 該蛋白至少有兩個重要的結構功能域，一個是具有ATP酶活性的可以剪切微管的AAA區(qū)結構域(ATPase associated with various cellular activities domain, AAA domain)，另一個是具有α螺旋結構，對ATP酶起調節(jié)作用的Vps4(vacuolar protein sorting 4，Vps4)碳端區(qū)域[7-8]. 從細菌到脊椎動物人類中均有fidgetin的同源基因存在，僅在脊椎動物中存在3個fidgetin同源基因，分別為fidgetin、fidgetinlike1(fidl-1)及fidgetinlike2(fidl-2).果蠅中Fidgetin與脊椎動物的Fidgetin like 1一致性最高. Yang的體外實驗顯示在細胞核與細胞質中均有Fidgetin like 1分布，而Fidgetin及Fidgetin like 2主要分布于細胞核中[9]. 小鼠的fidgetin發(fā)生突變會導致其耳蝸半規(guī)管缺失，而半規(guī)管的減少或缺失會導致突變小鼠出現左右搖頭的行為，突變小鼠還出現了小眼表型，這可能與細胞周期延遲和視網膜神經上皮細胞生長不良有關，以及少量骨骼異常如：顱骨融合、骨盆帶發(fā)育不全和多指畸形等現象[10].Fidgetinlike1的表達水平受成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor，FGF)及轉化生長因子(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的抑制，當在MC3T3-E1細胞中加入FGF及TGF-β1后fidgetinlike1表達明顯下調[11].在秀麗隱桿線蟲中(Caenorhabditiselegans,C.elegans)fidgetinlike1的同源基因是MEI-1，當其發(fā)生突變時，導致生殖干細胞停滯于有絲分裂期而導致線蟲不育[12]. 微管剪切蛋白Spastin突變導致的遺傳性痙攣性截癱[3]，最近新發(fā)現的Paget骨病也是由一種AAA蛋白VCP/p95突變引起的.Fidgetin是第一個被報道的與發(fā)育相關的AAA蛋白家族成員[10]. 到目前為止其體內功能尚不明確，特別是對神經系統(tǒng)發(fā)育的影響幾乎是個空白.

Fidgetin位于果蠅二號染色體的長臂的23E3區(qū)，它編碼的蛋白質與人類Fidgetin like 1同源性最高，一致性(identity)為30%，相似性(similarity)為48%，與Fidgetin like 2同源性最低(圖1). 在過去的數年中，對fidgetin功能的研究主要集中在體外培養(yǎng)細胞、線蟲及小鼠組織結構上，體外高表達fidgetin可以完全破壞培養(yǎng)細胞的微管網絡，使微管完全消失[13]. Cox等研究發(fā)現小鼠胚胎早期就有Fidgetin表達，發(fā)育晚期大腦中部分神經節(jié)有fidgetin較強的表達[10]. Fidgetin優(yōu)先靶向富含酪氨酸的動態(tài)微管區(qū)域，特別是在培養(yǎng)的星形膠質細胞遷移中起重要作用，實驗表明Fidgetin能促進源自大鼠脊髓的培養(yǎng)的星形膠質細胞的遷移[14]. Fidgetin作為微管剪切蛋白促進果蠅受損的樹突退化[15]. 在斑馬魚中，實驗顯示Fidgetin like 1通過調節(jié)微管末端動態(tài)來控制生長錐的導向、形態(tài)和行為[16]. Fidgetin-like 2，作為細胞遷移的基本調節(jié)因子，使用納米粒子包裹的小干擾RNA(siRNA)技術在小鼠體內進行靶向使fidgetin-like2功能缺失，可促進傷口閉合和再生[17]. 在體外，來自哺乳動物組織培養(yǎng)細胞的fidgetinlike2的缺失導致細胞運動速率增加超過兩倍，免疫熒光分析表明fidgetinlike2通常定位于細胞邊緣，重要的是定位于極化細胞的前沿，它調節(jié)微管細胞骨架的組織和動力學[18].

圖1 人類Fidgetin like 1和果蠅Fidgetin序列對比

1 材料與方法

1.1 果蠅品系見表1.

1.2 Immunostaining和western blotting所使用抗體見表2.

1.3 實驗中使用的載體見表3.

1.4 實驗中使用的引物見表4.

表1 本文中使用的果蠅品系

表2 本實驗使用抗體

表3 實驗中使用的載體

表4 實驗中使用的引物

1.5 實驗方法

1.5.1 sgRNA的設計 本實驗運用網頁工具CRISPR optimal target finder (網址http://tools.flycrispr.molbio. wisc.edu/targetFinder/) 在fidgetin的序列上設計了兩條sgRNA，序列標記為sgRNA 1、sgRNA 2. sgRNA1、sgRNA 2片段大小均在20 bp，在設計的sgRNA1、sgRNA2的5’端添加了BbsI 內切酶的酶切位點，再交由武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司合成帶有BbsⅠ酶切位點的單鏈sgRNA1、sgRNA2.

1.5.2 pCDF3 sgRNA表達載體的構建 將合成的兩條單鏈sgRNA DNA序列復性(見表5). 用BbsI內切酶切割pCDF3質粒，膠回收得到有BbsI粘性末端的線性pCDF3質粒. 為了使線性的pCDF3質粒與合成的sgRNA復性得到有BbsI粘性末端的短片段雙鏈DNA連接，取0.5 μL線性pCDF 3和4.5 μL雙鏈sgRNA于PCR管中混勻，再加入5 μL solution I，放在酶連儀中16 ℃反應2.5 h. 將酶連產物轉入trans1-T1大腸桿菌感受態(tài)中(來自全式金生物技術有限公司)，均勻涂在LA(加有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基)平板上，于37 ℃倒置過夜培養(yǎng). 挑取單菌落接種至5 mL LA液體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)10 h，抽提質粒并測序，將序列正確的質粒轉化至trans1-T1大腸桿菌感受態(tài)并涂布至LA平板培養(yǎng). 挑取單菌落于100 mL LA液體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)12 h，用QIAGEN中提試劑盒提取質粒并純化.由此得到pCDF3-sgRNA質粒表達載體，構建fidgetin無功能突變體果蠅的pCDF3 sgRNA表達載體命名為pCDF3-sgRNA1和pCDF3-sgRNA2質粒.

表5 sgRNA1與sgRNA rev結合為雙鏈gRNA

圖2 構建fidgetin無功能突變體實驗方案圖 將sgRNA1、sgRNA2質粒一起注射到nos-cas9果蠅和vasa-Cas9 果蠅胚胎，然后在注射后成活的果蠅中篩選目的果蠅

1.5.3 顯微注射 本實驗所用的顯微注射實驗流程主要來自本實驗室的成功案例[19-20]. 將pCDF3-sgRNA 1和pCDF3-sgRNA 2質?；旌显谝黄穑倽舛葹?50 ng/μL，注入nos-Cas9和vasa-Cas9果蠅產的胚胎中，將注射后成活的成蟲與Sp/CyO進行單只雜交得到子代F1，待F1羽化后在各個培養(yǎng)管中隨機挑選6～8只進行PCR鑒定.將鑒定有轉基因果蠅的培育管中的其它F1雄性果蠅與Sp/CyO雌性果蠅進行單只雜交，待后代產出，鑒定F1雄果蠅是否出現突變. 鑒定方法為：提取親本果蠅的DNA，將其作為模板，用設計好的引物fidgetinF和fidgetinR進行PCR，之后將PCR產物送到擎科生物公司測序，通過測序結果的峰圖讀出序列，因為非同源末端鏈接修復，可能會出現移碼突變. 構建fidgetin無功能突變體的實驗方案如圖2.

1.5.4 免疫印跡fidgetin無功能突變體果蠅與野生型果蠅三齡幼蟲各取5只，剖出內臟和大腦，留下皮，分別加入50 μL RIPA裂解液(強)和1 μL蛋白酶抑制劑放置于冰上進行研磨，在4 ℃，14 000 r/min離心10 min取上清，測蛋白濃度，配制上樣液. 在99 ℃水浴鍋中水浴10 min，然后點樣、電泳、轉膜(將蛋白轉移到PVDF膜上). 接著用0.5% PBST(1%PBS+0.5% Tween 20)配5% 的脫脂奶粉進行封閉1 h，加入一抗(anti-Fidgetin)在4 ℃過夜孵育，用0.5% PBST洗一抗1 h，每13 min更換一次PBST. 然后常溫孵育二抗2.5 h，洗二抗1 h，每13 min更換一次PBST. 在孵育過抗體的PVDF膜上加入曝光底物，最后顯影曝光.

1.5.5 圖片采集和數據處理 實驗中免疫組織染色均用Zeiss激光共聚焦顯微鏡LSM710采集，圖片采集后用Adobe Photoshop CS 6處理和排版. 本研究所進行的統(tǒng)計學實驗都在3個重復以上，每組實驗均用GraphPad Prism 5.0 軟件進行統(tǒng)計和數據分析，每次實驗若包括兩組實驗數據，則采用t-test進行統(tǒng)計學顯著性差異分析，若包括3組及以3組上實驗數據，則采用單因素方差分析(one-way ANOVA with Tukey’s test)進行統(tǒng)計學顯著性差異分析. 處理的所有定量數據均以平均值±標準誤(mean±S.E.M)的形式表示，在統(tǒng)計圖上的*表示的意義分別為：P> 0.05，沒有*(星號)說明兩組數據間差異不具有統(tǒng)計學意義；P< 0.05用*表示，說明兩組數據之間差異有統(tǒng)計學意義，P< 0.01用**表示，說明兩組數據之間差異有顯著統(tǒng)計學意義；P< 0.001用***表示，說明兩組數據差異有極顯著統(tǒng)計學意義.

2 結果

2.1 sgRNA表達載體的構建考慮到不同的sgRNA可能存在不同的靶向效率，本實驗設計了兩條sgRNA以確保實驗順利進行，將兩條sgRNA1和sgRNA2分別插入pCDF3表達載體中，測序(見圖3).

圖3 sgRNA表達載體的構建 A)sgRNA1與sgRNA2序列的設計；B)pCDF3-sgRNA表達載體酶切后檢測瓊脂糖電泳圖；C) pCDF3與 sgRNA連接后對表達載體檢測瓊脂糖電泳圖；D)pCDF3-sgRNA1和pCDF3-sgRNA2表達載體質粒檢測峰圖

圖4 fidgetin無功能突變體果蠅篩選 A) fidgetinM14-2突變體果蠅測序結果；B)純合個體fidgetinM14-2突變體果蠅和 野生型果蠅的序列對比，紅色標記為fidgetinM14-2突變體果蠅插入的堿基G

2.2 獲得fidgetinnull突變體果蠅將純化過的兩個pCDF3 sgRNA質粒稀釋至總濃度在150 ng/μL，即pCDF3 sgRNA1質粒、pCDF3 sgRNA2質粒各自稀釋至75 ng/μL混勻，注射入nos-Cas9果蠅和vasa-Cas9果蠅的胚胎中(胚胎發(fā)育時間為40 min)，總共注射了大約700只卵，成活30只，分別編號為F1～F10(雌性果蠅1～10號)和M1～M20(雄性果蠅1～20號). 將注射后成活的成蟲與Sp/CyO果蠅進行單只雜交得到子代F1，待子代F1羽化后在各個培養(yǎng)管中隨機挑選6～8只果蠅，提取DNA，用設計好的引物進行PCR，然后將PCR產物送至武漢擎科生物公司測序，根據測序結果的峰圖看是否有突變體果蠅產生，經鑒定，在F8、F10、M10、M12、M14這5管中讀取到有突變序列，將這5管的子代雄果蠅與Sp/CyO果蠅進行單只雜交，待子代產出，鑒定進行雜交的雄性親本果蠅，鑒定方法如前述(1.5.3)，最后篩選出M14中的親本雄果蠅的序列和野生型相比插入了一個堿基G(圖4)，導致發(fā)生移碼突變，命名為fidgetinM14-2突變體果蠅(可簡寫為fignM14-2).

圖5 FidgetinM14-2突變體果蠅蛋白水平的鑒定

2.3 穩(wěn)定遺傳的fidgetinM14-2果蠅品系的鑒定得到的純合fidgetinM14-2果蠅后，通過Western blot檢測蛋白的表達水平. 實驗中用到野生型和fidgetinM14-2兩個基因型果蠅，以actin作為參照，用Fidgetin的抗體檢測，實驗結果符合預期，如圖5，野生型檢測出Fidgetin的帶，而fidgetinM14-2果蠅沒有相對應的帶，則表明在fidgetinM14-2果蠅中，無Fidgetin蛋白表達，由此說明我們得到了fidgetin無功能突變體果蠅.

2.4Fidgetin調節(jié)神經肌肉突觸的發(fā)育為了檢測fidgetin是否影響神經突觸的發(fā)育，本實驗觀察了三齡幼蟲的神經肌肉接頭(neuromuscular junction, NMJ)，我們用標記神經細胞膜的HRP和標記突觸囊泡的CSP進行免疫染色，使用激光共聚焦顯微鏡拍攝，GraphPad Prism 5.0 軟件進行統(tǒng)計和數據分析，統(tǒng)計結果顯示野生型的神經突觸扣結分布均勻，神經系統(tǒng)敲減了fidgetin(elav-Gal4;UAS-fidgetinRNAi)和fidgetinM14-2突變體果蠅的NMJ扣結數目增加. 我們統(tǒng)計了各個基因型的三齡幼蟲的第三體節(jié)四號肌肉的NMJ總扣結數目，fidgetinRNAi果蠅扣結數是(37 ± 2.22)個，和野生型(28 ± 0.98)個比較有顯著增加(P< 0.01)，fidgetinM14-2突變體果蠅的扣結數目是(39 ± 2.24)個，和野生型(28 ± 0.98)個比較有極顯著增加(P< 0.001)，如圖6所示.

圖6 Fidgetin調節(jié)神經肌肉突觸的發(fā)育 A)將野生型、 fidgetin RNAi及fidgetinM14-2突變體果蠅的三齡幼蟲解剖染色，紅色標記的是突出 囊泡的CSP，綠色標記的是神經細胞膜的HRP； B)柱狀統(tǒng)計圖顯示的是野生型、 fidgetin RNAi及fidgetinM14-2 突變體果蠅的扣結總數目(樣本數n分別為WT：18； fidgetinM14-2：20； fidgetin RNAi：25)

3 討論

本實驗用黑腹果蠅作為模式生物，運用CRISPR/Cas9技術對果蠅的fidgetin基因進行編輯，獲得了fidgetin的無功能突變體果蠅fidgetinM14-2. 有研究表明神經網絡結構的錯誤調控會導致果蠅神經肌肉突觸發(fā)育的異常[21].實驗中我們觀察到fidgetinRNAi、fidgetinM14-2突變體果蠅表型一致，兩者NMJ的扣結數目較野生型數目顯著增加. 這個結果和其他微管剪切蛋白Katania 60和Spastin的突變體的NMJ表型不同[22]，katania60突變體總衛(wèi)星扣結數目增加，spastin的突變體的NMJ的分支數增加，說明3種微管剪切蛋白從不同的方面調節(jié)果蠅神經肌肉突觸的生長. 此結果也說明fidgetin對果蠅神經肌肉突觸的發(fā)育是必須的.fidgetinM14-2突變體果蠅的NMJ的扣結數目較野生型數目顯著增加，可能會降低信號在NMJ上的傳遞效率. 另外，Fidgetin在果蠅發(fā)育過程中的其他方面的影響還需進一步探討.