不同酶處理對(duì)再造煙葉梗膏的提質(zhì)效果

羅海濤， 劉思奎， 何 力， 任周營(yíng)， 席鵬飛， 段賓賓*

〔1.江西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司， 江西 南昌 330096； 2.云南瑞升煙草技術(shù)(集團(tuán))有限公司， 云南 昆明 650106〕

造紙法再造煙葉主要生產(chǎn)工藝是將煙葉和煙梗分別用水浸提萃取，萃取液固液分離，固體部分制漿后抄制成紙基，液體部分濃縮后回涂到基片上。造紙法再造煙葉可作為卷煙填充料使用，是廢棄物資源化利用的產(chǎn)品，在一定程度上可使卷煙的物理性能和化學(xué)成分按要求調(diào)整或改善，從而提高卷煙的內(nèi)在品質(zhì)，且在卷煙中具有降焦和減害功能[1-2]。造紙法再造煙葉使用的原料均是低次煙葉和煙梗，煙梗是烤煙打葉復(fù)烤的副產(chǎn)物，通常在卷煙中作為膨脹梗絲、梗片和顆粒梗等填充料的原料[3-4]，在再造煙葉中主要提供纖維以及部分涂布用的涂布料，傳統(tǒng)再造煙葉涂布料中煙梗提取物(以下簡(jiǎn)稱梗膏)用量占比為40%～50%。由于煙梗是用水浸提，大分子化合物在制備過(guò)程中幾乎不發(fā)生轉(zhuǎn)化，梗膏中仍殘留大量的不溶性蛋白、果膠和淀粉等，直接使用在抽吸方面會(huì)產(chǎn)生熱辣和發(fā)苦等不足，同時(shí)木質(zhì)雜氣突出，煙草本香略顯單薄，從而導(dǎo)致再造煙葉產(chǎn)品香氣平淡，木質(zhì)雜氣重、熱辣感強(qiáng)等吸味缺陷。為提高產(chǎn)品品質(zhì)，對(duì)梗膏進(jìn)行相關(guān)酶處理可達(dá)到增加煙香濃度、降低刺激和改善余味的目的[5-7]。

國(guó)內(nèi)外對(duì)改善梗膏抽吸品質(zhì)研究較多的增香方法有美拉德反應(yīng)和微生物(生物酶)發(fā)酵[8-11]，其中以蛋白酶、木質(zhì)素酶和果膠酶對(duì)煙梗纖維性能的改善研究較多。宋凌勇等[12]研究認(rèn)為，涂布液通過(guò)生物酶作用可增加再造煙葉產(chǎn)品的致香成分，從而提升再造煙葉的內(nèi)在品質(zhì)。駱莉等[13]在煙梗提取液中加入α-淀粉酶、糖化酶GAⅡ、纖維素酶和風(fēng)味蛋白酶等，得到的煙梗提取液致香物質(zhì)含量明顯增加。為此，選用酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶和多酚氧化酶3種酶制劑對(duì)梗膏進(jìn)行酶處理，對(duì)處理后的梗膏進(jìn)行致香成分分析，將處理后的梗膏制備成再造煙葉產(chǎn)品并對(duì)其進(jìn)行有害成分分析及感官質(zhì)量評(píng)價(jià)，進(jìn)一步驗(yàn)證3種酶處理梗膏的提質(zhì)作用及提高其利用率，為梗膏在卷煙生產(chǎn)上的提質(zhì)增效提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1葉膏、梗膏、基片和基料葉膏、梗膏和基片，江西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司提供；基料，云南瑞升煙草技術(shù)(集團(tuán))有限公司提供。

1.1.2試劑酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶和多酚氧化酶，均由寧夏夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司提供；無(wú)水硫酸鈉(分析純)，天津市福晨化學(xué)試劑廠；二氯甲烷(分析純)，鄭州派尼化學(xué)試劑廠。

1.1.3儀器SHA-B 2002型恒溫水浴振蕩器，常州國(guó)華電器有限公司；DK-98-Ⅰ型電子恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；AL204型天平(感量0.000 1 g)，Mettler-toledo Group；GC6890N/MS 5975 氣相/質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent公司；QS-Ⅱ試樣切絲機(jī)，鄭州天宏自動(dòng)化技術(shù)有限公司；打煙器，德國(guó)制造；煙管，云南某卷煙品牌。

1.2方法

1.2.1樣品制備將酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、多酚氧化酶先用適量水稀釋，在常溫下用磁力攪拌器以40 r/min攪拌15 min，使酶充分溶解、過(guò)濾后備用。

1.2.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)梗膏共設(shè)3個(gè)處理，具體處理如下：T0，為對(duì)照，未經(jīng)過(guò)酶處理的梗膏。T1，取一定質(zhì)量的木瓜蛋白酶溶解液加入梗膏(密度為1.200±0.008 g/cm3，pH為6.5)中混勻，使木瓜蛋白酶在梗膏中的活力濃度為3 000 U/mL，在55℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min的恒溫水浴振蕩器中保溫60 min后加入酸性蛋白酶，使其在梗膏中的活力濃度為150 U/mL。在55℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min的恒溫水浴振蕩器中保溫120 min后冷卻至室溫備用(不需要進(jìn)行滅活處理)。T2，取一定質(zhì)量的木瓜蛋白酶溶解液加入梗膏(密度為1.200±0.00 8 g/cm3，pH為6.5)中混勻，使木瓜蛋白酶在梗膏中的活力濃度為3 000 U/mL，在55℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min的恒溫水浴振蕩器中保溫60 min后加入多酚氧化酶，使其在梗膏中的活力濃度為300 U/mL。在55℃，轉(zhuǎn)速為150 r/min的恒溫水浴振蕩器中保溫120 min后，冷卻至室溫備用(不需要進(jìn)行滅活處理)。

1.2.3成分測(cè)定

1) 致香成分。樣品制備：分別準(zhǔn)確稱取T0～T2梗膏各1.00 g，各加入20 mL二氯甲烷，置于60 mL梨形分液漏斗中，震蕩后靜置20 min，取下層萃取液。樣品共萃取3次，合并萃取液。向合并后的萃取液中加入無(wú)水硫酸鈉靜置2 h，除去水分，將萃取液過(guò)濾后，加入濃度為0.1 mol/L的乙酸苯乙酯50 μL作為內(nèi)標(biāo)液，搖勻后取樣進(jìn)行GC/MS分析。分析條件參照文獻(xiàn)[14]的方法進(jìn)行，色譜條件：色譜柱為HP-5MS (30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛細(xì)管柱，載氣為氦氣，進(jìn)樣量1.0 L，分流比20∶1，柱流速0.8 mL/min；程序升溫的初始溫度為50℃，保持1 min，然后以8℃/min升溫至160℃，保持2 min，再升至260℃，保持15 min；傳輸線溫度280℃，進(jìn)樣口溫度250℃。質(zhì)譜條件：EI電離能量為70 eV，離子源溫度230℃，溶劑延遲2 min，掃描離子質(zhì)量35～550 amu，NIST06數(shù)據(jù)庫(kù)，采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析，由云南同創(chuàng)分析檢測(cè)中心完成測(cè)定。

2) 煙氣化學(xué)成分。再造煙葉樣品制備：準(zhǔn)確稱取葉膏5.0 g，T0、T1、T2梗膏各4.0 g，葉膏5.0 g，香料1.0 g，加入15.0 g自來(lái)水在玻璃皿中進(jìn)行混勻，制成涂布液。將涂布液在烤箱中105℃加熱5 min，將涂布液均勻涂布于再造煙葉基片上，控制涂布率為(30±1)%，制成再造煙葉產(chǎn)品。將3個(gè)產(chǎn)品放置于溫度(22±1)℃和相對(duì)濕度(60±2)%的平衡室中平衡48 h后切絲，制成卷煙分別標(biāo)記為Y0、Y1和Y2(煙支重量0.84±0.005) g。對(duì)Y0、Y1和Y2進(jìn)行煙氣化學(xué)成分測(cè)定，由云南同創(chuàng)分析檢測(cè)中心測(cè)定。

參照文獻(xiàn)[15-17]的方法測(cè)定卷煙主流煙氣總粒相物、焦油、煙堿和水分等常規(guī)成分釋放量；參照文獻(xiàn)[18-24]的方法測(cè)定卷煙煙氣中CO、HCN、NNK、NH3、B[a]P、苯酚及巴豆醛的釋放量；參照文獻(xiàn)[25]的方法計(jì)算卷煙危害性指數(shù)(H)。

涂布率=(涂布后質(zhì)量-涂布前質(zhì)量)/涂布后質(zhì)量×100%

式中，XCO為卷煙主流煙氣中CO釋放量實(shí)測(cè)值(mg/支)，XHCN為卷煙主流煙氣中HCN釋放量實(shí)測(cè)值(μg/支)，XB[a]P為卷煙主流煙氣中B[a]P釋放量實(shí)測(cè)值(ng/支)，X巴豆醛為卷煙主流煙氣中巴豆醛釋放量實(shí)測(cè)值(μg/支)，X苯酚為卷煙主流煙氣中苯酚釋放量實(shí)測(cè)值(μg/支)，XNH3為卷煙主流煙氣中NH3釋放量實(shí)測(cè)值(μg/支)，XNNK為卷煙主流煙氣中NNK釋放量實(shí)測(cè)值(ng/支)。CCO，CHCN，CB[a]P，C巴豆醛，C苯酚，CNH3和CNNK分別為2008年度全國(guó)卷煙主流煙氣中CO、HCN、B[a]P、巴豆醛、苯酚、NNK和NH3釋放量加權(quán)平均值，分別為14.2、146.3、10.9、18.6、17.4、8.1和5.5。

1.2.4感官評(píng)吸Y0、Y1和Y23個(gè)樣品以標(biāo)準(zhǔn)GB 5606.4-2005卷煙第四部分感官技術(shù)要求為基礎(chǔ)[26]，評(píng)吸指標(biāo)包括嗅香、諧調(diào)、香氣量、香氣質(zhì)、雜氣、余味和刺激性等指標(biāo)，各指標(biāo)按評(píng)吸質(zhì)量檔次分別給予不同的分值，并計(jì)算評(píng)吸質(zhì)量總分，由云南瑞升煙草技術(shù)(集團(tuán))有限公司的卷煙感官評(píng)吸小組(5人)進(jìn)行感官質(zhì)量評(píng)吸。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同處理梗膏的致香成分

從表1看出，梗膏中的致香成分按其功能團(tuán)的不同可將其分為醇類、醛類、酮類、酚類、酸類、雜環(huán)類、酯類和烯烴類共計(jì)8大類34種致香成分。醇類：有糠醇、苯甲醇、苯乙醇和3-氧代-α-紫羅蘭醇共4種致香成分，T0和T1中未檢出3-氧代-α-紫羅蘭醇；各成分合計(jì)依次為T2>T1>T0，T0、T1和T2分別為2.450%、9.785%和23.112%。醛類：有糠醛、3-甲基-2-丁烯醛、2-吡啶甲醛、苯甲醛、5-甲基糠醛、1H-吡咯-2-甲醛和苯乙醛共7種成分；T0和T1中未檢出1H-吡咯-2-甲醛；各成分合計(jì)依次為T2>T1>T0，T0、T1和T2分別為10.632%、11.884%和19.470%。酮類：有3-羥基-2-丁酮、面包酮、2-環(huán)戊烯-1,4-二酮、1-(2-呋喃基)-乙酮、2-羥基-3-甲基-2-環(huán)戊烯-1-酮、1-(1H-吡咯-2-基)-乙酮、茄酮、β-大馬、巨豆三烯酮B和巨豆三烯酮D共10種致香成分，T1中未檢出2-羥基-3-甲基-2-環(huán)戊烯-1-酮；各成分合計(jì)依次為T2>T1>T0，T0、T1和T2分別為16.385%、18.037%和21.460%。酚類：有苯酚和2-甲氧基-4-乙烯基苯酚共2種致香成分，T0和T1處理中未檢出苯酚；各成分合計(jì)依次為T2>T1>T0，T0、T1和T2分別為1.063%、2.219%和4.313%。酸類：有糠酸、十五酸和十六酸共3種致香成分，T0和T1未檢出十五酸；各成分合計(jì)依次為T2>T1>T0，T0、T1和T2分別為1.053%、1.499%和4.479%。雜環(huán)類：有吡啶、吲哚、去氫去甲基煙堿(麥斯明)和2,3'-聯(lián)吡啶共4種致香成分；各成分合計(jì)依次為T2>T1>T0，T0、T1和T2分別為2.210%、2.908%和3.021%。酯類：有丁內(nèi)酯、二氫獼猴桃內(nèi)酯和十六酸甲酯共3種致香成分，T0和T1未檢出十六酸甲酯；各成分合計(jì)依次為T2>T0>T1，T0、T1和T2分別為1.899%、1.439%和6.202%。烯烴類：僅有新植二烯1種致香成分，但其是所有致香成分中含量最高的物質(zhì)；各成分合計(jì)依次為T2>T0>T1，T0、T1和T2分別為9.432%、10.699%和13.531%。致香物質(zhì)總量：34種致香成分總量依次為T2>T0>T1，T0、T1和T2分別為45.124%、58.470%和95.588%。在8個(gè)大類致香成分中，除酯類致香成分含量T1較T0有所降低外，其余類別致香成分含量T1和T2均較T0增加。T1較T0增加幅度最大的為醇類物質(zhì)，T2較T0增加幅度較大的有醇類、醛類、酚類、酸類和酯類。

表1 不同處理梗膏各致香成分的含量

2.2不同處理梗膏再造煙葉產(chǎn)品主流煙氣的成分

2.2.1常規(guī)成分從表2可知，不同酶處理梗膏再造煙葉產(chǎn)品總粒相物、水分、煙氣煙堿量和焦油量主流煙氣的常規(guī)成分的含量變化?？偭Ｏ辔铮篩0含量最高，為5.91 mg/支，Y2最低，為4.68 mg/支；Y1和Y2較Y0分別下降11.84%和20.81%。水分：Y2含量最高，為0.61 mg/支，Y1最低，為0.26 mg/支；Y2較Y0上升24.49%，Y1較Y0下降46.94%。煙氣煙堿量：Y0和Y1含量相近，分別為0.26 mg/支和0.25 mg/支；Y2最低，為0.23 mg/支，Y2較Y0下降11.54%。焦油量：Y0含量最高，為5.14 mg/支，Y2最低，為3.75 mg/支；Y1和Y2較Y0分別下降8.56%和27.04%?？梢?jiàn)，經(jīng)過(guò)不同酶處理可使再造煙葉產(chǎn)品燃燒更加充分。

表2 不同處理梗膏再造煙葉產(chǎn)品主流煙氣的常規(guī)成分

2.2.2有害成分從表3可知，不同處理再造煙葉產(chǎn)品CO、HCN和B[a]P等主流煙氣有害成分釋放量的變化。CO、HCN和B[a]P等7種主流煙氣中，Y1除NNK含量較Y0有所增加外，其余6個(gè)指標(biāo)含量均較Y0有所降低，CO、HCN、B[a]P、巴豆醛、苯酚和NH3較Y0分別降低6.28%、54.29%、68.79%、1.31%、53.51%和28.57%，且HCN、B[a]P和苯酚均降低50%以上。Y2的7種主流煙氣較Y0均有所降低，CO、HCN、B[a]P、巴豆醛、苯酚、NH3和NNK較Y0分別降低16.21%、40.00%、80.49%、13.25%、58.86%、22.86%和26.74%，且B[a]P和苯酚均降低50%以上。危害性指數(shù)，Y0最高，為5.19；Y2最低，為3.29，Y1和Y2再造煙葉產(chǎn)品危害性指數(shù)較Y0分別下降17.92%和36.61%。

表3 不同處理梗膏再造煙葉產(chǎn)品主流煙氣7種有害成分的釋放量

2.3不同處理梗膏再造煙葉產(chǎn)品的感官評(píng)價(jià)質(zhì)量

從表4看出，不同處理再造煙葉產(chǎn)品的嗅香、諧調(diào)、香氣質(zhì)、香氣量、雜氣、余味和刺激性等煙氣感官評(píng)價(jià)得分的變化。所有指標(biāo)得分和總分Y1和Y2均高于Y0，Y1和Y2總分分別較Y0提高13.38%和21.83%。3個(gè)處理的描述性評(píng)吸結(jié)果：Y0，煙氣較為甜潤(rùn)，香氣濃度稍欠，質(zhì)地略顯粗糙，稍有刺激和木質(zhì)雜氣，口腔殘留稍有，余味稍苦。Y1與Y0比，煙氣透發(fā)性略有增加，煙香較為濃郁，甜香較為凸顯，刺激略有降低，雜氣微有，口腔殘留稍有，余味尚舒適。Y2與Y0比，香氣的透發(fā)性與豐富性提升明顯，煙香較為濃郁，甜香凸顯，與煙香協(xié)調(diào)、香氣透發(fā)、細(xì)膩，刺激與殘留較低，余味較舒適。綜合看，經(jīng)過(guò)木瓜蛋白酶和多酚氧化酶處理的再造煙葉產(chǎn)品優(yōu)于木瓜蛋白酶和酸性蛋白酶處理的再造煙葉產(chǎn)品，且二者均優(yōu)于未經(jīng)過(guò)酶處理的再造煙葉產(chǎn)品。

表4 不同處理梗膏再造煙葉產(chǎn)品的感官評(píng)吸質(zhì)量

3結(jié)論與討論

采用酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶和多酚氧化酶處理梗膏，經(jīng)GC/MS分析，經(jīng)酶處理梗膏致香物質(zhì)的含量增加明顯，與宋凌勇等[12-13]針對(duì)生物酶處理的研究結(jié)果一致，也進(jìn)一步證實(shí)不同酶處理梗膏更有利于具有香氣特征的小分子化合物積累，從而增加梗膏的致香物質(zhì)含量，特別是木瓜蛋白酶和多酚氧化酶對(duì)梗膏處理后其致香物質(zhì)含量顯著增加。

不同酶處理梗膏可使大分子物質(zhì)水解為糖、氨基酸等小分子物質(zhì)，并促使具有香氣特征小分子化合物的合成、轉(zhuǎn)化和積累，從而增加梗膏的致香物質(zhì)含量，改善梗膏的抽吸品質(zhì)。不同酶處理的梗膏致香成分含量較高的有糠醇、糠醛、苯乙醛、苯甲醇、2-環(huán)戊烯-1,4-二酮、1-(1H-吡咯-2-基)-乙酮、茄酮、β-大馬酮、吡啶、丁內(nèi)酯和新植二烯等，其均是煙草中重要的致香成分。其中，糠醇、糠醛、1-(1H-吡咯-2-基)-乙酮、吡啶屬于美拉德棕色化反應(yīng)產(chǎn)物；苯乙醛和苯甲醇屬于苯丙氨酸類降解產(chǎn)物；2-環(huán)戊烯-1,4-二酮和β-大馬酮屬于類胡蘿卜素類降解產(chǎn)物，具有提高煙氣濃度的作用；茄酮和丁內(nèi)酯屬于類西柏烷類降解產(chǎn)物。前述致香成分具體表現(xiàn)為糠醇、糠醛具有甜的面包香，可增強(qiáng)和改進(jìn)卷煙的香氣和吃味；苯乙醛有濃郁的花香，苯甲醇具有較弱的花香，均可協(xié)調(diào)煙香；2-環(huán)戊烯-1,4-二酮具有甜香，β-大馬酮可賦予煙葉木香、花香，特別具有充分成熟的煙草香味特征，可提升煙氣豐富度；茄酮具有平和的酮味，丁內(nèi)酯是茄酮氧化的產(chǎn)物，具有甜香，有利于卷煙香氣的保持[28-29]。

目前，煙草及其制品的安全性爭(zhēng)議較多，但在卷煙安全性方面，特別是針對(duì)主流煙氣中有害成分的釋放量，煙草行業(yè)內(nèi)有表征的代表性指標(biāo)[30]，除卷煙焦油和煙堿外，還有一氧化碳(CO)、氫氰酸(HCN)、苯并[a]芘(B[a]P)、巴豆醛，苯酚、氨(NH3)和4-(N-甲基-N-亞硝氨基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)等7項(xiàng)。通過(guò)對(duì)3種酶處理梗膏制備的再造煙葉進(jìn)行卷煙主流煙氣7項(xiàng)有害成分釋放量及危害性指數(shù)進(jìn)行對(duì)比分析，并結(jié)合卷煙的感官評(píng)價(jià)結(jié)果表明，不同酶處理梗膏制備的再造煙葉可有效降低卷煙煙氣中的有害成分，提高香氣濃度、降低木質(zhì)雜氣、豐富煙香，使煙氣更加柔和、細(xì)膩。

采用3種酶對(duì)梗膏進(jìn)行處理，通過(guò)致香物質(zhì)分析、有害成分分析和感官質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果表明，不同酶對(duì)煙膏和其制備的再造煙葉產(chǎn)品具有明顯的提質(zhì)作用。其中，木瓜蛋白酶和多酚氧化酶處理的再造煙葉產(chǎn)品更優(yōu)于木瓜蛋白酶和酸性蛋白酶處理再造煙葉產(chǎn)品，經(jīng)酶處理的梗膏樣品致香成分增加明顯，卷煙主流煙氣7項(xiàng)有害成分釋放量及危害性指數(shù)均下降，再造煙葉產(chǎn)品的抽吸品質(zhì)改善明顯，質(zhì)量明顯提升?？梢?jiàn)，不同酶處理梗膏在生產(chǎn)應(yīng)用上具有重要的理論和實(shí)踐意義，可將其進(jìn)一步推廣至生產(chǎn)實(shí)踐中，在保障產(chǎn)品質(zhì)量安全的前提下，可有效提高梗膏的利用率。