眼子菜莖的組織培養(yǎng)及快速繁殖體系建立

宋 倫，洪開文，宋 澤，鄭 重，劉 晶，扶長杰

(1.安順職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 安順 561000； 2.黔中民族藥(苗藥)資源開發(fā)與產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心, 貴州 安順 561000； 3.貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽 550000)

眼子菜(PotamogetondistinctusA. Bennett J. Bot.)是眼子菜科(Potamogetonaceae)眼子菜屬 (Potamogeton)多年生水生草本植物。廣布于我國南北大多數(shù)省區(qū)，生于池塘、水田和水溝等靜水中，水體多呈微酸性至中性，是一種常見的稻田雜草，有時甚至是惡性雜草[1]。眼子菜屬植物入藥最早記載于明初期，朱橚編撰的《救荒本草》一書中載有菹草(PotamogetoncrispusLinnaeus Sp. Pl.)，即水藻，生于池塘及水泊中，莖如麄線，長100～133 cm，葉形似柳葉而狹長，故名柳葉菹；其葉似篷子葉，根麄?cè)玮O股而色白，味微咸性微寒。明代蘭茂《滇南本草》中記載牙齒草，又名牙拾草。生于田中，味苦、澀，性寒。止赤白痢疾，大腸下血、婦人紅崩漏下，惡血。其中的牙齒草即為眼子菜。在《中藥大辭典》中記載眼子菜具有清熱利水、止血消腫、驅(qū)蛔的功效。主治痢疾、黃疸、淋病、帶下、血崩、痔血、蛔蟲病、瘡瘍紅腫等。

眼子菜屬成分、藥理等研究相對較少，WARFARIN等[2]利用二氯甲烷從光葉眼子菜(PotamogetonlucensLinnaeus)中萃取出一種已知的呋喃糖苷和2種新型糖苷及羥基化脂肪酸，其均對月牙藻具有抑制作用；對比另外幾類眼子菜屬植物的非極性萃取物發(fā)現(xiàn)，這類糖苷在眼子菜屬植物中普遍存在。易道生等[3]用馬來眼子菜(PotamogetonintortusifoliusJ. B. He, L. Y. Zhou & H. Q. Wang)提取馬來眼子菜多糖，證明馬來眼子菜多糖Ⅰ(PMPSⅠ)由D-果糖和D-木糖組成，而馬來眼子菜多糖Ⅱ(PMPSⅡ)由 D-葡萄糖、D-果糖和另一未知單糖成分組成。KURASHOV等[4]第一次對小眼子菜(PotamogetonpusillusLinnaeus)的揮發(fā)油進(jìn)行GC-MS分析，共測出133種揮發(fā)油組分。眼子菜屬植物除含蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸、纖維素等常見成分外，還含有豐富的類胡蘿卜素[5-6]。眼子菜(PotamogetondistinctusA. Bennett J. Bot.)具有相應(yīng)的中藥藥理作用、抗癌活性、抗氧化活性、抑菌抗炎活性、細(xì)胞因子誘導(dǎo)活性和其他藥理作用[7]，且對污染河道氮、磷有凈化吸收作用，可以充分調(diào)動河道的底質(zhì)肥力、加速氮磷循環(huán)、豐富水中營養(yǎng)鹽、提高水體生產(chǎn)力，對治理污染河道水體有重大意義[8-9]。在《陸磯詩疏》《毛晉詩疏廣要》《爾雅》《救荒本草》及《本草綱目》等古籍中均有關(guān)于眼子菜屬植物食用的記載。同時眼子菜屬植物主要營養(yǎng)成分與稻谷相一致，氨基酸與玉米相近，還含有一些生理活性成分和微量元素，可提高動物免疫力和肌肉品質(zhì)，因其野生能力較強(qiáng)、資源豐富、容易采集，是家畜、家禽和草食性魚類喜食的青綠飼料[10-11]。

眼子菜具有一定的潛在藥用價值和水生態(tài)恢復(fù)、食用、飼用價值。在農(nóng)業(yè)上，眼子菜的相關(guān)研究在于如何防治[12]。對于該資源的開發(fā)和利用研究較少。眼子菜以全草或休眠芽入藥，采集時莖易斷，入藥部位難以大量收集。目前，鮮見眼子菜組織培養(yǎng)(以下簡稱“組培”)的相關(guān)研究報道。為此，以眼子菜莖為試驗材料，研究不同濃度6-糠基氨基嘌呤(KT)、萘乙酸(NAA)、6-芐基氨基嘌呤(6-BA)、吲哚丁酸(IBA)、無機(jī)鹽和糖對眼子菜莖段出芽數(shù)、葉片數(shù)、根狀莖節(jié)數(shù)、生根數(shù)的影響，以期為眼子菜快速繁殖體系的建立及其應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1材料

試驗材料：眼子菜，于2019年5月采集于安順市西秀區(qū)蔡官鎮(zhèn)稻田中，經(jīng)檢索《中國植物志》等相關(guān)資料鑒定為眼子菜。模擬其生境栽培于安順職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用醫(yī)藥系中藥學(xué)專業(yè)實訓(xùn)地中。取長勢健壯植株的幼嫩莖段為外植體進(jìn)行試驗。

試劑：MS培養(yǎng)基(Murashige和Skoog 1962，固體培養(yǎng)基)，貴陽誠承化工設(shè)備有限公司；6-糠基氨基嘌呤(KT)、萘乙酸(NAA)、6-芐基氨基嘌呤(6-BA)、吲哚丁酸(IBA)，上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司；無菌水，自制。

儀器：超凈工作臺，蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司；YM30Z高壓蒸汽滅菌器，上海三申醫(yī)療器械有限公司；光照培養(yǎng)箱，上?，槴\實驗設(shè)備有限公司。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件根據(jù)試驗?zāi)康牟煌砑硬煌瑵舛鹊闹参锷L調(diào)節(jié)劑。以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，附加蔗糖3%，瓊脂均為6 g/L，pH均調(diào)至5.8～6.0，1/2MS培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中大量元素減半，附加蔗糖1.5%，其他成分不變。配制的培養(yǎng)基使用高壓蒸汽鍋121℃滅菌30 min。使用純凈水高壓滅菌制得無菌水。無菌營養(yǎng)液為使用MS培養(yǎng)基配方而不添加植物調(diào)節(jié)劑、蔗糖和瓊脂配制，高壓滅菌而得。培養(yǎng)溫度(25±1)℃，光周期12 h/d，光強(qiáng)約為60 μmol/m2·s，培養(yǎng)周期根據(jù)培養(yǎng)階段不同而變化。

1.2.2外植體消毒處理取長勢健壯的眼子菜幼嫩莖段，在自來水下沖洗1 h，無菌紗布濾干。于超凈工作臺上用浸泡75%乙醇的棉花擦拭1次，去除多余葉片、葉苞和不定根，并用無菌手術(shù)刀將其切成小段(每段需有2個莖節(jié))。將切成小段的眼子菜用無菌水沖洗2次，75%酒精充分浸泡40 s，再用0.1%升汞充分浸泡10 min，取出后用無菌水沖洗3次，置入裝有無菌水的玻璃杯中等待接種。

1.2.3不定芽的誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)將消毒好的外植體接種(平放于培養(yǎng)瓶中)到A(MS+KT 0.1 mg/L+NAA 0.05 mg/L)、B(MS+KT 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L)、C(MS+KT 0.05 mg/L+NAA 0.05 mg/L)、D(MS+KT 0.05 mg/L+NAA 0.1 mg/L)培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)，每組10次重復(fù)，每瓶4個外植體。萌芽后開始記錄其出芽數(shù)，每2 d觀察記錄數(shù)據(jù)1次。16 d為1個培養(yǎng)周期，將誘導(dǎo)培養(yǎng)出來的芽進(jìn)行繼代或增殖培養(yǎng)。

1.2.4增殖培養(yǎng)將誘導(dǎo)出的不定芽切割分離為單株，接種于增殖培養(yǎng)基E1(MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.05 mg/L)、E2(MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.05 mg/L+無菌水)、E3(MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.05 mg/L+營養(yǎng)液)、F1(MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L)、F2(MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L+無菌水)、F3(MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.05 mg/L+營養(yǎng)液)、G1(MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L)、G2(MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+無菌水)、G3(MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+營養(yǎng)液)、H1(MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.1 mg/L)、H2(MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.1 mg/L+無菌水)、H3(MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.1 mg/L+營養(yǎng)液)中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，每組10次重復(fù)，每瓶4個單株。接種后第3天開始記錄其新增出芽數(shù)、葉片數(shù)和根狀莖節(jié)數(shù)，每2 d觀察記錄數(shù)據(jù)1次。8 d為1個培養(yǎng)周期，達(dá)到生根壯苗要求的數(shù)量時進(jìn)行下一步生根培養(yǎng)。

1.2.5生根培養(yǎng)與煉苗移栽將增殖培養(yǎng)的眼子菜植物取出，接種于生根培養(yǎng)基I1(MS+IBA 0.5 mg/L)、I2(MS+IBA 0.5 mg/L+無菌水)、I3(MS+IBA 0.5 mg/L+營養(yǎng)液)、J1(MS+IBA 1 mg/L)、J2(MS+IBA 1 mg/L+無菌水)、J3(MS+IBA 1 mg/L+營養(yǎng)液)、K1(1/2MS+IBA 0.5 mg/L)、K2(1/2MS+IBA 0.5 mg/L+無菌水)、K3(1/2MS+IBA 0.5 mg/L+營養(yǎng)液)、L1(1/2MS+IBA 1 mg/L)、L2(1/2MS+IBA 1 mg/L+無菌水)、L3(1/2MS+IBA 1 mg/L+營養(yǎng)液)中進(jìn)行生根培養(yǎng)，每組10次重復(fù)，每瓶1株眼子菜組培苗。接種后第3天開始記錄其新增出芽數(shù)、新增葉片數(shù)、新增根狀莖節(jié)數(shù)和生根數(shù)，每2 d觀察記錄數(shù)據(jù)1次。6 d為1個培養(yǎng)周期，將生根后的眼子菜組培苗打開瓶蓋，在培養(yǎng)室放置2 d。將植株從培養(yǎng)基中取出，去除苗根部的培養(yǎng)基，種植于帶有泥土的水箱中，水深2 cm，土深10 cm。放置在溫室陰涼處，常規(guī)管理。10 d后統(tǒng)計移栽成活率及苗生長狀況。

1.2.6評定規(guī)則按照各個階段的不同制定不同的評分標(biāo)準(zhǔn)，對每組每個指標(biāo)求平均值，然后賦予每個指標(biāo)一定評分( 滿分為100分)權(quán)重。

2結(jié)果與分析

2.1不同濃度KT和NAA對眼子菜芽誘導(dǎo)的影響

從表1可知，當(dāng)KT與NAA濃度分別為0.1 mg/L和0.05 mg/L時，眼子菜莖段的誘導(dǎo)出芽數(shù)最低，為2.7個，綜合評分為27分；當(dāng)KT與NAA濃度分別為0.05 mg/L和0.1 mg/L時，眼子菜莖段的誘導(dǎo)出芽數(shù)最高，為13個，評分為100分。綜合分析，當(dāng)KT/NAA濃度比為較低時，有利于眼子菜芽的誘導(dǎo)，當(dāng)KT/NAA濃度比為較高時，對眼子菜芽的誘導(dǎo)有一定的抑制作用。

表1 不同濃度KT和NAA處理眼子菜的出芽誘導(dǎo)狀況

2.2不同處理對眼子菜增殖培養(yǎng)的影響

由于第8天后部分培養(yǎng)瓶中葉片數(shù)量較多，難以觀察記錄指標(biāo)，故以第8天的記錄數(shù)據(jù)進(jìn)行指標(biāo)評分。從表2可知，E1處理的評分最高，為72.4分，出芽數(shù)、生長葉片數(shù)和根狀莖數(shù)均最大，分別為5.3個、9張和8.3節(jié)； H1處理的綜合評分最低，為21.4分，其出芽數(shù)、生長葉片數(shù)和根狀莖節(jié)分別為1.3個、2.5張和2.8節(jié)。綜合分析，當(dāng)6-BA濃度為1 mg/L，NAA濃度為0.05 mg/L，不添加無菌水或無菌營養(yǎng)液時，有利于眼子菜的增殖培養(yǎng)；當(dāng)6-BA濃度為1 mg/L，NAA濃度為0.1 mg/L，不添加無菌水或無菌營養(yǎng)液時，眼子菜的增殖培養(yǎng)效果差。

表2 不同處理眼子菜的增殖培養(yǎng)狀況

2.3不同處理對眼子菜生根培養(yǎng)的影響

從表3可知，K2處理的綜合評分最高，為76.2分，其出芽數(shù)、葉片數(shù)、根狀莖數(shù)和生根數(shù)分別為5.7個、15.0張、8.7條和13.7條。G1處理的綜合評分最低，為17.8分，其出芽數(shù)、葉片數(shù)、根狀莖數(shù)和生根數(shù)分別為0.8個、4.5張、1.8條和1.8節(jié)。綜合分析，當(dāng)培養(yǎng)基中無機(jī)鹽、有機(jī)質(zhì)等含量較少，IBA濃度較低，添加無菌水時，有利于眼子菜根的誘導(dǎo)培養(yǎng)；當(dāng)培養(yǎng)基中無機(jī)鹽、有機(jī)質(zhì)等含量較高，IBA濃度較高時，對根的誘導(dǎo)培養(yǎng)有一定的抑制作用。

2.4組培苗移栽的存活率

煉苗結(jié)束后將組培苗移栽于帶有泥土的水箱中，放置在溫室陰涼處，常規(guī)管理。10 d后統(tǒng)計移栽成活率為98%。

表3 不同處理眼子菜的生根培養(yǎng)狀況

3結(jié)論與討論

研究表明，眼子菜芽的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+KT 0.05 mg/L+NAA 0.1 mg/L，該條件下的出芽數(shù)為10個，大部分形成不定芽，誘導(dǎo)能力很好；眼子菜的最佳增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 1 mg/L+NAA 0.05 mg/L，其出芽數(shù)、葉片數(shù)和根狀莖數(shù)分別為5.3個，9張和8.3節(jié)；眼子菜的最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 0.5 mg/L+無菌水，其出芽數(shù)、葉片數(shù)、根狀莖數(shù)和生根數(shù)分別為5.7個，15.0張、8.7節(jié)和13.7根；眼子菜莖的組培苗在模擬水田環(huán)境中存活率高，為98%，無需其他處理。

眼子菜的組織培養(yǎng)材料存在不易消毒、操作等特點(diǎn)，在培養(yǎng)過程中對組培苗進(jìn)行觀察記錄時受制約因素較多，很難準(zhǔn)確地對植株生長狀況進(jìn)行評定。試驗在參考前人研究其他植物組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，對各培養(yǎng)階段的眼子菜指標(biāo)給予評分，再進(jìn)行分析，能較為客觀地反映各處理間的總體差異，得到的試驗結(jié)果更加客觀和具有說服力。

研究在參考同屬植物竹葉眼子菜的組織培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上，對生長調(diào)節(jié)劑濃度進(jìn)行了調(diào)整，在增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)時考慮到眼子菜的水生環(huán)境，特別制造了液態(tài)環(huán)境(添加無菌水或無菌營養(yǎng)液)。通過試驗初步探索出眼子菜莖的組織培養(yǎng)方案，構(gòu)建了以眼子菜莖為外植體誘導(dǎo)分化成苗的快繁體系，為后續(xù)眼子菜同屬植物組織培養(yǎng)的研究提供一定的研究基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

眼子菜資源分布廣、蘊(yùn)藏量大，對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)危害嚴(yán)重，但其藥理方面的研究報道相對較少。若在成分、藥理等研究跟進(jìn)的情況下，對該資源進(jìn)行開發(fā)利用，農(nóng)業(yè)上將會找到另一種治理眼子菜的途徑。