中西藥聯(lián)用對雞源沙門氏菌的體外抗菌活性

樊國燕， 黃 慧， 李慧娟， 張立恒， 婁 飛， 王曉琳， 裴亞玲， 李榮譽(yù)

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院， 河南 鄭州 450046)

抗菌藥物為畜禽健康養(yǎng)殖提供了重要保障，但大量、廣泛使用甚至濫用抗菌藥物導(dǎo)致強(qiáng)耐藥性的細(xì)菌出現(xiàn)和傳播，給公共衛(wèi)生健康帶來巨大威脅。沙門氏菌、彎曲菌及金黃色葡萄球菌是感染畜禽的三類主要食源性致病菌，且畜禽源分離株對常用抗菌藥物的耐藥率已處于較高水平[1]。范忠軍等[2]研究表明， 56株雞源腸炎沙門氏菌分離株對22種抗生素表現(xiàn)出不同程度的耐藥性，其中對青霉素和紅霉素的耐藥性分別高達(dá)98.21%和96.43%。沈?qū)W懷等[3-5]研究均證實(shí)沙門氏菌(Salmonella)對大部分抗菌藥物的耐藥情況嚴(yán)重。 2017年主要臨床分離菌種分布前20位中，沙門氏菌排第19位，并且近幾年均排在前20位[6]。沙門氏菌的耐藥性問題在國外同樣引起重視，WHITE等[7]研究發(fā)現(xiàn)，美國腸道沙門氏菌亞種I型是與人類沙門氏菌病相關(guān)的5種最常見細(xì)菌型之一，主要表現(xiàn)為對氨芐西林、鏈霉素、磺胺類藥物和四環(huán)素的耐藥性，已成為一個(gè)公共衛(wèi)生問題。WHITE等[7]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，沙門氏菌確診和疑似感染源為活的動物環(huán)境、肉類和家禽以及寵物等，通過對食品安全和檢驗(yàn)服務(wù)(FSIS)監(jiān)管的肉類和家禽產(chǎn)品的分離物進(jìn)行研究，在多個(gè)FSIS產(chǎn)品類別中均發(fā)現(xiàn)了低水平的耐藥沙門氏菌，表明該病原體的宿主范圍相對較廣。為探究沙門氏菌的耐藥機(jī)制，黃慧等[8]對18株臨床分離的沙門氏菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)及基因分子特征分析發(fā)現(xiàn)，有4株為耐藥菌株，耐藥率22.2%，說明沙門氏菌對恩諾沙星產(chǎn)生耐藥性與gyrA基因突變密切相關(guān)，gyrA基因喹諾酮耐藥區(qū)(QRDR)的雙突變可使沙門氏菌對恩諾沙星的耐藥性增強(qiáng)。

為探求解決細(xì)菌耐藥性問題，人們不斷尋找抗生素替代品，具有抗菌作用的中藥有望成為獸用抗菌藥物替代品之一。不過許多中草藥雖然具有抗菌活性，但單獨(dú)應(yīng)用起效較慢，抗菌活性相對不強(qiáng)，中藥單獨(dú)用于獸醫(yī)臨床效果還不太理想，中藥與抗菌西藥合理聯(lián)合應(yīng)用可以提高療效，降低化學(xué)合成抗菌藥物或抗生素的用量，消除或逆轉(zhuǎn)耐藥現(xiàn)象[9]，可取得單獨(dú)使用中藥或抗菌藥所不能取得的治療效果。藥物組合可以幫助有機(jī)體對抗多重耐藥(MDR)細(xì)菌感染[10]。為探索中藥、西藥聯(lián)合應(yīng)用的抑菌效果，以雞源沙門氏菌為試驗(yàn)菌株，選用黃芩、黃連、大黃、恩諾沙星、鹽酸環(huán)丙沙星、硫酸新霉素、硫酸阿米卡星幾種藥物，分別單獨(dú)或采用不同中西藥組合進(jìn)行體外抑菌效果試驗(yàn)，以期篩選出與西藥具有協(xié)同抗菌作用的中藥，為獸醫(yī)臨床用藥提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1中藥和西藥品種中藥品種3個(gè)，分別為黃芩、黃連和大黃，均購自北京同仁堂大藥房。西藥品種4個(gè)，分別為恩諾沙星(含量99.5%，批號DK03-1806235，上虞京新藥業(yè)有限公司)，鹽酸環(huán)丙沙星(含量88.5%，批號DK15-1712241-6，上虞京新藥業(yè)有限公司)、硫酸阿米卡星(653 U/mg，批號 20160413，浙江永寧藥業(yè)股份有限公司)、硫酸新霉素(651 U/mg，批號 201708007，宜昌三峽制藥有限公司)。

1.1.2試驗(yàn)菌株雞源沙門氏菌菌株，由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院獸醫(yī)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室從河南地區(qū)養(yǎng)殖場分離、鑒定、保存。質(zhì)控菌大腸桿菌(ATCC?25922)由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)饋贈。

1.1.3主要儀器可見分光光度計(jì)(型號VIS-7220G，北京萊伯泰科儀器有限公司)，立式高壓蒸汽滅菌鍋(型號LDZX-50KBS，上海申安醫(yī)療器械廠)，分析天平(型號BSA224S，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，振蕩培養(yǎng)箱(型號YKC-100B)，恒溫培養(yǎng)箱(型號LRH-250)，潔凈工作臺(型號JJ-CJ-2FD)，96孔V型板，微量移液槍(100 μL、200 μL、1 000 μL)，八連排槍 200 μL。

1.2方法

1.2.1中藥水提液制備采用水煎法制備中藥水提液，將黃芩、黃連、大黃各取100 g，加純化水1 000 mL，浸泡30 min，煎煮1 h，紗布過濾；濾液保存，濾渣加純化水600 mL，煎煮30 min，紗布過濾；合并兩濾液，文火濃縮至100 mL，得濃度為1 g/mL的藥液；高壓滅菌，冰箱4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2西藥藥液制備精密稱取硫酸新霉素、硫酸阿米卡星、鹽酸環(huán)丙沙星適量，分別置于50 mL容量瓶中，用適量水溶解，定容；精密稱取恩諾沙星適量，置于50 mL容量瓶中，加入1/2體積的水后，逐滴加1 mol/L的NaOH至最終溶解，加水定容；新霉素、阿米卡星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星計(jì)，藥物最終濃度均為1 280 μg/mL。藥液配成后，0.22 μm微孔濾膜過濾，分裝在EP管內(nèi)，冰箱4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3菌種復(fù)蘇及菌液制備

1) 菌種復(fù)蘇。取沙門氏菌菌種 50 μL接種于5 mL的LB 肉湯中，于35℃、220 r/min震蕩培養(yǎng)過夜，得復(fù)蘇菌液；挑取新鮮復(fù)蘇的菌液接種于LB瓊脂培養(yǎng)板上，35℃倒置培養(yǎng)16～18 h，菌種復(fù)蘇。

2) 菌液制備。菌種復(fù)蘇后，用接種環(huán)蘸取3～4 個(gè)單菌落接種于LB肉湯，于35℃、220 r/min 震蕩培養(yǎng)8～12 h，培養(yǎng)過程中，每隔20 min用紫外分光光度計(jì)測1次菌液的OD625值；當(dāng)菌液OD625值在0.08～0.13時(shí)(菌液濃度約為 1×108cfu/mL)，將菌液用MH 肉湯按 1∶1 000 稀釋，備用。

1.2.4單藥最小抑菌濃度(MIC)測定及結(jié)果判定采用96孔V型滅菌反應(yīng)板，用微量肉湯二倍稀釋法[11]測定黃芩、黃連、大黃、恩諾沙星、鹽酸環(huán)丙沙星、硫酸新霉素、硫酸阿米卡星對雞沙門氏菌的單藥最小抑菌濃度(MIC)值，同法測定質(zhì)控菌的MIC值，重復(fù)3次。以美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)動物源細(xì)菌抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)(2017年版)[12]為參考(表1)，比較質(zhì)控菌對西藥的MIC值是否符合要求，判定試驗(yàn)菌株對抗菌藥的敏感性。參照李東等[13]的判定標(biāo)準(zhǔn)判斷試驗(yàn)菌株對中藥的敏感性，MIC>250 mg/mL為不敏感，MIC在125～250 mg/mL為低敏，MIC15.63～62.5 mg/mL為中敏，MIC≤7.81 mg/mL為高敏。根據(jù)4種西藥對質(zhì)控菌的MIC測定值，均在質(zhì)控菌MIC允許范圍內(nèi)，說明試驗(yàn)條件符合要求。

表1 受試菌對4種西藥敏感性及判定標(biāo)準(zhǔn)

1.2.5聯(lián)合用藥部分抑菌濃度(FIC)指數(shù)測定與結(jié)果判定采用微量肉湯棋盤稀釋法[11]測定聯(lián)合用藥的FIC指數(shù)。根據(jù)測得的單藥對試驗(yàn)菌株的MIC值，以抗菌藥MIC的16倍、8倍、4倍、2倍、1倍、1/2倍、1/4倍濃度分別進(jìn)行聯(lián)合，并設(shè)中藥、西藥單藥對照及細(xì)菌對照，測定聯(lián)合用藥對雞沙門氏菌的抗菌效果，以FIC指數(shù)為聯(lián)合藥敏試驗(yàn)的判斷依據(jù)。判斷標(biāo)準(zhǔn)[14]：FIC指數(shù)≤0.5為協(xié)同作用，0.52為拮抗作用。

2結(jié)果與分析

2.1沙門氏菌對抗菌中藥和西藥的敏感性

從表2看出，試驗(yàn)菌株對選用的抗菌西藥硫酸新霉素、硫酸阿米卡星比較敏感，對恩諾沙星、鹽酸環(huán)丙沙星均表現(xiàn)耐藥。說明一些抗菌藥物已經(jīng)出現(xiàn)了耐藥現(xiàn)象，所以在臨床上應(yīng)考慮抗菌藥物的選擇及其合理應(yīng)用，以減輕細(xì)菌的耐藥。試驗(yàn)菌株3種抗菌中藥敏感程度不同，其中，黃連的抗菌效果最佳，屬于高敏；黃芩次之，大黃也具有一定的敏感性。由此看出，選用中藥作為抗菌藥是可行的，但在臨床上對于中藥抗菌藥物的選擇時(shí)，應(yīng)進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，以達(dá)到理想的抗菌效果。

表2 雞沙門氏菌對抗菌西藥和中藥的敏感性

2.2抗菌中藥和西藥聯(lián)合使用對沙門氏菌的抗菌作用

從表3看出，4種抗菌西藥與3種抗菌中藥組成的藥物組合中，呈協(xié)同作用的有3組，分別為恩諾沙星+黃芩，恩諾沙星+黃連和鹽酸環(huán)丙沙星+黃連；呈相加作用的有2組，分別為硫酸新霉素+黃連和硫酸阿米卡星+黃連；呈無關(guān)作用的有2組，分別為恩諾沙星+大黃和鹽酸環(huán)丙沙星+大黃；其余4組表現(xiàn)為拮抗作用。由此看出，抗菌西藥與抗菌中藥聯(lián)合應(yīng)用對病原菌的抗菌效果有協(xié)同相加、無關(guān)和拮抗作用。因此，在臨床藥物選擇上，應(yīng)考慮藥物之間的合理配置，充分發(fā)揮中、西藥聯(lián)用的抗菌效果。

表3 抗菌中藥與西藥聯(lián)用對雞源沙門氏菌的抗菌效果

3結(jié)論與討論

細(xì)菌耐藥性已越來越引起人們的關(guān)注，且政府部門也采取了相應(yīng)的措施，禁抗、限抗已提上日程。為此，加大細(xì)菌耐藥性機(jī)制的研究，建立快速檢測方法，篩選抗菌中藥均不失為一種很好的應(yīng)對措施。中藥作為我國的瑰寶，在畜禽養(yǎng)殖方面的應(yīng)用也日趨廣泛，其抗菌活性的研究重視度也越來越高。研究結(jié)果顯示，黃芩、黃連、大黃對雞源沙門氏菌均具有一定的體外抑菌效果，但敏感程度不同，與倪吉榮[15]的研究結(jié)論相同。王明英等[16]研究也證實(shí)，杜仲葉提取液對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌敏感程度不同，而對變形桿菌和枯草桿菌不敏感。由于不同的中藥其敏感程度不同，在選擇中藥作為抗菌藥時(shí)，應(yīng)根據(jù)不同的致病菌選擇不同的中藥，同時(shí)對其抑菌效果進(jìn)行考察，以確保治療效果，為獸醫(yī)臨床上選擇中藥抗菌藥提供參考依據(jù)。

中藥與西藥聯(lián)用試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)了協(xié)同、相加、無關(guān)甚至拮抗的情況。朱利霞等[17]分析中草藥與抗生素聯(lián)用對狐貍源大腸桿菌的體外抑菌效果，也出現(xiàn)了相同情況。王洪彬等[18]進(jìn)行的中西藥聯(lián)用對舌鰨源嗜水氣單胞菌的體外抑菌效果研究，則出現(xiàn)了拮抗、無關(guān)、相加，沒有出現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)，與筆者等進(jìn)行的的硫酸阿米卡星與黃芩、黃連、大黃3種中藥聯(lián)用試驗(yàn)結(jié)果類似。而硫酸新霉素、硫酸阿米卡星分別與大黃、黃芩聯(lián)用后出現(xiàn)拮抗作用，原因可能是2種藥混合，發(fā)生了物理或化學(xué)性質(zhì)的改變，其產(chǎn)生的機(jī)理還需進(jìn)一步研究。中西藥聯(lián)用不一定都會出現(xiàn)協(xié)同作用，BROCHADO等[19]認(rèn)為，拮抗作用僅發(fā)生在靶向不同細(xì)胞進(jìn)程的藥物之間，而協(xié)同作用經(jīng)常發(fā)生在靶標(biāo)相同細(xì)胞過程的藥物之間。據(jù)此推斷，產(chǎn)生無關(guān)或拮抗作用的原因可能是2種藥物的作用位點(diǎn)不同所致。在中西藥聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，應(yīng)進(jìn)行FIC指數(shù)檢測，以選擇具有協(xié)同作用的藥物組合，進(jìn)而達(dá)到理想的抑菌效果。

中藥抗菌藥一直被認(rèn)為是安全低殘留的藥物，且是限抗、減抗替代品的最佳選擇。但張炳亮等[20]研究表明，其研究的23株豬源大腸桿菌對測試的中藥均有不同程度的耐藥性，試驗(yàn)菌株對甘草耐藥率高達(dá)82.6%，生地耐藥率達(dá)78.2%。研究雖未出現(xiàn)中藥耐藥的情況，但理論上出現(xiàn)中藥耐藥性是可能的。據(jù)此可以看出，中藥使用不當(dāng)，同樣會出現(xiàn)耐藥情況。因此，在使用中藥作為抗菌藥時(shí)對其產(chǎn)生的耐藥性也應(yīng)引起高度重視。

致謝：試驗(yàn)部分內(nèi)容由河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動物藥學(xué)專業(yè)學(xué)生馬佩文、王磊磊完成，在此一并感謝！