納米吲哚菁綠酶響應(yīng)水凝膠的合成及體外抗腫瘤實驗研究*

王歡歡 李 煒 付之光 張建軍 溫 寧

口腔癌是全身最常見的惡性腫瘤之一，其中舌癌的發(fā)病率占口腔癌的首位[1]。在過去的幾十年中，這類疾病新發(fā)和死亡病例在全球范圍內(nèi)均呈逐年上升趨勢，且患病年齡趨于年輕。舌癌惡性程度高、局部復(fù)發(fā)率高、頸部轉(zhuǎn)移率高，成為嚴(yán)重威脅我國居民健康的一類癌癥[2]。目前臨床上常用的治療手段是以手術(shù)為主的綜合治療。由于舌是重要的發(fā)音咀嚼器官，如何在減少功能障礙的基礎(chǔ)上，提高患者的生存率，是目前急需解決的問題[3]。

光療以其微創(chuàng)、靶向性好、不良反應(yīng)小、可重復(fù)治療等優(yōu)勢，在口腔癌治療中展現(xiàn)了廣闊的應(yīng)用前景[4-6]。腫瘤光療包括光熱治療(PTT)和光動力治療(PDT)。在光照條件下，光熱治療通常與光動力療法同時存在，光熱治療將光能轉(zhuǎn)換成熱能殺死腫瘤細胞;而光動力療法中，光能將光敏劑激發(fā)產(chǎn)生活性氧(ROS)，從而誘發(fā)腫瘤細胞死亡[7]。吲哚菁綠(ICG)是美國食品藥物監(jiān)督管理局(FDA)唯一批準(zhǔn)用于臨床近紅外成像試劑，可介導(dǎo)疾病的診斷和治療。吲哚菁綠作為一種光敏劑，可以吸收近紅外光，將其轉(zhuǎn)化為熱能或產(chǎn)生活性氧，可用于腫瘤的光熱治療和光動力治療[8,9]。臨床上主要通過靜脈注射光敏劑，然后近紅外光照射病變部位，達到治療效果。治療后由于皮膚內(nèi)殘留的光敏劑清除需要一定時間，患者在注射光敏劑后的一個來月中，需避免陽光直射或強烈的燈光照射，以防止光過敏反應(yīng)發(fā)生。吲哚菁綠水溶液很不穩(wěn)定，在血漿中可快速清除(半衰期150～180 秒)，還具有光毒性，限制了其在診斷治療方面的應(yīng)用[10,11]。

近年來納米技術(shù)迅速發(fā)展，將藥物納米化能夠有效改善化療藥物水溶性和穩(wěn)定性，高藥物利用率和抗腫瘤活性，降低對機體正常細胞組織的毒副作用，克服多藥耐藥性問題，進而提高抗腫瘤療效[12]。在本研究中，為了最大限度提高光敏劑吲哚菁綠的利用率、減少全身毒副作用，我們將納米化的吲哚菁綠裝載至我們自主研制的基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)水凝膠中，以期為舌癌治療提供新策略。

1.材料和方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 主要材料和試劑 ICG、MTT 試劑盒(Sigma,USA)；交聯(lián)劑HS-MMP-SH (GenScript,USA)；高糖培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清(FBS)、96孔板、青霉素、鏈霉素、胰酶、培養(yǎng)皿(Hyclone,USA)；MMP-2(北京義翹神州科技有限公司,中國)；活性氧檢測試劑盒(碧云天，中國)；NuncTMLab-TekTM 腔室載玻片系統(tǒng)(Thermo,USA)

1.1.2 主要儀器 激光器NBT-785-3W(北京紐比特科技有限公司，中國)；紅外熱成像儀TiS20(Fluke,USA)；激光共聚焦顯微鏡TCS-SP5(Leica,GER)；移液器(Eppendorf,GER)二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(Thermo,USA)粒度儀ZS90(Malvern,UK)掃描電子顯微鏡JSM-701(JEOL,JPN)；EpochTM超微量微孔板分光光度計(Bio Tek,USA)

1.1.3 細胞 人舌鱗癌細胞株(SCC-15)(ATCC,USA)

1.2 方法

1.2.1 吲哚菁綠納米顆粒(nano ICG)的制備與表征 (1)將20mg 游離ICG 溶解于4 mL 二甲基亞砜(DMSO)中，然后加入80mg 活性劑Poloxamer 188 并充分攪拌。(2)將40mL 磷酸鹽緩沖液(PBS)添加到上述溶液中，然后劇烈攪拌，使用去離子水透析4h，重復(fù)3 次去除有機溶劑。(3)將溶液冷凍干燥，獲得nano ICG。

利用透射電鏡(TEM)和動態(tài)光散射(DLS)技術(shù)對nano ICG 的形態(tài)、尺寸分布和Zeta 電位進行表征。

1.2.2 透明質(zhì)酸-丙烯酸酯(HA-Ac)的合成參照Tatiana Segura 等的研究方法[13]通過三步法合成HA-Ac。

1.2.3 將nano ICG 裝載至HA-Ac (1)準(zhǔn)確稱取1.2 mg nano ICG 凍干粉末，加入40μL 三乙醇胺(TEOA)緩沖液混合均勻，并放入超聲儀中震蕩30min。(2)準(zhǔn)確稱取8mg 的HA-Ac 加入160μL TEA 緩沖液，混合均勻，放入37℃恒溫箱中30min，充分溶解。(3)將兩者充分混合，加入2mg 的交聯(lián)劑HS-MMP-SH，混合均勻，放置在37℃恒溫箱中交聯(lián)成膠，形成納米吲哚菁綠基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)水凝膠(nano ICG@MMP-gel，nano ICG 6mg/mL)。

利用掃描電鏡(SEM)觀察nano ICG@MMPgel 形態(tài)及藥物分布情況；同時為后續(xù)實驗研究，制備了基質(zhì)金屬蛋白酶水凝膠，并利用掃描電鏡觀察微觀結(jié)構(gòu)。

1.2.4 nano ICG@MMP-gel 藥物釋放實驗(1)將nano ICG@MMP-gel 分為兩組，一組置入含有MMP-2(1.0μg/mL)的1mLPBS 中，另一組置入等量的PBS 中，并轉(zhuǎn)移到透析袋里，透析袋放入含有20ml 相同溶質(zhì)的試管中，37℃水浴。(2)在特定時間下，取液測定在795nm 波長下的吸光度，并等量補足。(3)參照ICG 的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算不同條件下nano ICG 的溶出量，并繪制溶出速率曲線。

1.2.5 體外光熱實驗 將500μL 的PBS、游離ICG 溶液、游離nano ICG 溶液、nano ICG@MMP-gel 到24 孔板中(每組3 個副孔，ICG 濃度均為6mg/mL)。待膠體凝固后，使用近紅外激光(808nm，0.8W/cm2，6min)照射，同時采用紅外熱成像系統(tǒng)實時監(jiān)控每組溫度變化情況。

1.2.6 細胞內(nèi)活性氧檢測 (1)取對數(shù)生長期SCC-15 細胞，胰酶消化后接種于NuncTMLab-TekTM腔室載玻片系統(tǒng)(1.0×105個/孔)中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱過夜。(2)每孔分別加入50μL PBS、游離ICG 溶液、游離nano ICG 溶液、nano ICG@ MMP-gel 溶液孵育4h，最后用激光照射，條件為808nm，0.5W/cm2，6min。(3)去除舊的培養(yǎng)基，每孔加入2',7’-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)活性氧檢測染料工作液，37℃下孵育20min。(4)吸除染色工作液，并用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞3 遍。(5)用激光共聚焦顯微鏡檢測各組細胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長525nm。

1.2.7 體外抑瘤實驗 (1)接種處于生長對數(shù)期的SCC-15 細胞至96 孔板(2×103個/孔)，終體積為100μL，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱過夜。(2)待細胞貼壁后，去除舊培養(yǎng)基，分別加入20μL PBS，智能水凝膠(MMP-gel)、nano ICG@MMP-gel、nanoICG@MMP-gel+MMP-2(1.0μg/mL)[14]；待成膠后加入100 uL 新鮮培養(yǎng)基。(3)孵育4h 后，使用激光(808nm，0.5W/cm2,6min)照射。(4)進一步培養(yǎng)2 天后，每孔加入20μLMTT。(5)培養(yǎng)4h 后，將培養(yǎng)液吸出，使用PBS 洗滌一次，加入100uL 的DMSO。(6)放置37℃恒溫箱5min 后，使用酶標(biāo)儀檢測在570nm 波長下的OD值，計算每組的抑瘤率。

1.2.8 體外劃痕試驗 (1)取生長對數(shù)期的SCC-15 細胞接種至6 孔板中(5×103個/孔)，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱過夜。(2)棄掉舊培養(yǎng)基，PBS 清洗，用白色槍頭在細胞板內(nèi)筆直劃線，置于顯微鏡下拍照，記錄此時劃痕距離(0h)。(3)分別加入50μL MMP-gel、nano ICG@MMPgel、nanoICG@MMP-gel+MMP-2(1.0μg/mL),重新加入無血清培養(yǎng)基，孵育4h 后用近紅外激光(808nm，0.5W/cm2，6min)照射,繼續(xù)培養(yǎng)20h。(4)再次棄掉舊培養(yǎng)基,PBS 清洗,置于顯微鏡下拍照,記錄此時劃痕距離(24h)。(5)Image J 軟件對遷移距離進行比較分析。

1.2.9 體外侵襲試驗 (1)將直徑為8mm 的侵襲小室置于24 孔板，將50mg/mL 基質(zhì)膠稀釋5倍，取30μL 鋪在小室底部，待凝固。(2)將1×105個細胞懸浮于300μL 無血清培養(yǎng)基中接種至小室內(nèi)，小室外加入500μL 含20%血清培養(yǎng)基。(3)然后分別加入50μLMMP-gel、nanoICG@MMP-gel、nanoICG@MMP-gel+MMP-2(1.0μg/mL)，孵育4h 后用近紅外激光(808nm，0.5W/cm2，6min)照射，繼續(xù)培養(yǎng)20h。(4)取出Transwell 小室，棄掉培養(yǎng)液，用PBS 沖洗三次后，用0.2%結(jié)晶紫染色20min。(5)用棉簽輕輕擦掉上表面未遷移細胞，在光學(xué)顯微鏡下對染色細胞計數(shù)，并對結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 所有實驗結(jié)果均采用均數(shù)(x)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，使用GraphPad Prism 6.0 繪制圖表、SPSS 22.0 進行統(tǒng)計分析。采用t 檢驗評價兩組間的差異的顯著性，P＜0.05 被認為是有統(tǒng)計學(xué)差異(*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001)。

2.結(jié)果

2.1 吲哚菁綠納米粒子的表征 從透射電鏡圖中可以看出，納米吲哚菁綠大多呈球形，具有良好的單分散性(圖1)，通過DLS 檢測，可以得出納米吲哚菁綠粒徑分布圖(圖2)。

圖1 納米吲哚菁綠透射電鏡圖

圖2 納米吲哚菁綠粒徑分布圖

2.2 載藥水凝膠的表征 nano ICG@MMP-gel在37℃條件下，5～8min 成膠，具有良好的膠凝時間，大體形態(tài)圖如圖4 所示。根據(jù)圖5 可以看出，載藥水凝膠呈疏松多孔狀結(jié)構(gòu)(平均孔徑約為50μm)，吲哚菁綠納米顆粒在智能水凝膠孔隙中分布均勻(圖2)。

圖3 nano ICG@MMP-gel大體形態(tài)圖

圖4 nano ICG@MMP-gel掃描電鏡圖

2.3 載藥水凝膠的釋放曲線 為評估nano ICG@MMP-gel 藥物釋放特性，我們繪制了nano ICG 的釋放曲線。如圖5 所示，在含有MMP-2 的環(huán)境下，nano ICG@MMP-gel 第1 天內(nèi)nano ICG有輕度突釋現(xiàn)象，大約有46%釋放，5 天時釋放了75%左右，以后漸趨穩(wěn)定，10 天后釋放超過85%。與對照組PBS 相比，nano ICG 在MMP-2 溶液中的釋放速度更快，濃度更高。綜上可知，nano ICG@MMP-gel 具出良好的MMPs 敏感特性和理想的藥物釋放能力。

圖5 藥物釋放曲線

2.4 載藥水凝膠的光熱特性 通過圖6 可以看出，隨著光照時間的延長，各組的溫度也逐漸增高。其中，在激光照射6 min(808nm，1.0W/cm2)后，PBS、游離ICG 的最高溫度分別上升到了30℃和40.2℃(圖7)。與游離ICG 溶液相比，游離nano ICG 溶液溫度上升更高46.6℃，其可能原因為納米藥物的尺寸較小，受熱更均勻充分。值得注意的是，在激光照射下，nano ICG@MMP-gel 的溫度增加到48.5℃，比游離nano ICG 溶液要高，這可能是因為水凝膠比水溶液具有更強的熱涵養(yǎng)能力和(或)更低的熱耗散能力。綜上可以看出，nano ICG@MMP-gel 具有良好的光熱性能。

圖6 光熱曲線圖

圖7 各組最大光熱圖

2.5 載藥水凝膠的活性氧檢測 為了檢測激光照射后各組ROS 的產(chǎn)生情況，我們借助激光共聚焦顯微鏡檢測了細胞內(nèi)的熒光強度。如圖8，9 所示，在808nm 激光照射后，游離nano ICG 組比游離ICG 溶液有較強的熒光，說明將ICG 制備成納米級別有利于活性氧的增加；而游離nano ICG 組與nano ICG@MMP-gel 組熒光強度統(tǒng)計學(xué)無顯著差異，說明改變nano ICG 的載藥形式，并不會影響ROS 的產(chǎn)生。綜上可知，nano ICG@MMPgel 具有良好的光動力特性，可作為活性氧的供者來殺腫瘤細胞。

圖8 各組活性氧生成的熒光圖

圖9 活性氧定量圖

2.6 載藥水凝膠的體外藥效學(xué)研究 增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲是腫瘤細胞的三大重要特征。為了研究nano ICG@MMP-gel 體外抗腫瘤作用，我們首先用MTT 法評價各組的治療效果。如圖10 所示，智能水凝膠組與PBS 組相比，細胞增殖率無顯著性差異，說明智能水凝膠對細胞無毒副作用。而nano ICG@MMP-gel+MMP-2 組的抑瘤率明顯高于nano ICG@ MMP-gel，說明nano ICG@MMP-gel 在富含MMP-2 的環(huán)境中，nano ICG放增多，能有效的抑制SCC-15 的增殖。

圖10 各組抑瘤率

接下來，我們通過體外劃痕實驗研究了nano ICG@MMP-gel 能否抑制SCC-15 細胞的轉(zhuǎn)移。如圖11，12 所示，nano ICG@MMP-gel 組抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移，而nano ICG@MMP-gel+MMP-2組與nano ICG@MMP-gel 組無顯著性差異。其可能原因是，雖然MMPs 能促進nano ICG 的釋放，抑制腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移，然而MMPs 本身卻可以降解細胞外基質(zhì)和基底膜，促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移[15]，所以兩組之間無顯著統(tǒng)計學(xué)差異。最后我們從體外侵襲試驗中得出了類似的結(jié)論(圖13，14)，即引入外源MMP-2，并不能因nano ICG 的釋放增加而增強侵襲能力。

圖11 劃痕實驗

圖12 劃痕實驗定量分析

圖13 侵襲實驗

圖14 侵襲實驗定量分析

3.討論

近年來，隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)、光學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，生物治療、光療等為腫瘤治療帶來新的希望。其中光療憑借其靶向特異性高、微創(chuàng)、不良反應(yīng)小以及可重復(fù)治療等優(yōu)勢，成為淺表及腔體腫瘤的有效治療策[4,6,16]。光療包括光熱治療和光動力治療。光熱治療指的是在激光照射下，通過激光產(chǎn)生的高熱量來破壞消除腫瘤細胞。當(dāng)溫度上升至42℃以上時，腫瘤細胞會因DNA 合成及修復(fù)能力減弱、蛋白質(zhì)變性、細胞內(nèi)含氧量下降或pH 值降低等原因而導(dǎo)致腫瘤細胞死亡[17]。光動力治療主要通過特定波長的光照射病變部位，將選擇性聚集在病變組織的光敏劑激活，產(chǎn)生單線態(tài)氧或自由基，從而引發(fā)光化學(xué)反應(yīng)達到治療目的。特定波長的光、光敏劑、活性氧是光動力治療的三大基本要素[7]。

2006 年，Paiva，M.B 等使用Nd:YAG 激光對在62 例頭頸部腫瘤患者進行腫瘤熱消融治療，結(jié)果顯示激光熱療治療腫瘤具有可行性，并且安全性高[18]。Joel A 等報道了106 例通過激光熱療治療復(fù)發(fā)性頭頸部腫瘤，結(jié)果顯示，激光熱療對于口腔腫瘤效果最好，平均生存時間為29.1 個月，而頸部腫瘤患者生存時間為14.4±6.9[19]。以上說明光熱療法可作為復(fù)發(fā)性腫瘤姑息治療手段。2007 年，有研究報道了1990 年至2006 年共收治276 例早期口腔癌和喉癌病例，光動力單次治療早期喉癌和口腔癌的治愈率分別達到了91%和94%[16]。例如一名65 歲的女性患者，下唇及前庭溝區(qū)的淺表部位患有鱗狀細胞癌(T2N0)。以2mg/kg 的劑量靜脈注射卟吩姆鈉后給予激光照射(639nm，50J/cm2)，6 個月后，腫瘤細胞完全消除，并且光照部位愈合良好，基本無疤痕。一名63 歲的男性患者，鱗癌位于左側(cè)真假聲帶(T2N0)及右側(cè)扁桃體(T4N0)，聲音嘶啞伴吞咽困難。扁桃體癌選擇手術(shù)切除，聲帶處的鱗癌選擇光動力治療，靜脈注射卟吩姆鈉兩天后給予光照(630nm，100J/cm2)。兩個月后喉鏡檢查，顯示聲帶鱗癌已治愈，兩年半內(nèi)無復(fù)發(fā)。

目前的光動力治療主要采用靜脈注射光敏劑，然后局部施以光照。光敏劑大多具有光毒性，主要表現(xiàn)為皮膚局部的紅疹或水泡。如何將光敏劑的毒副作用降到最低，是值得思考的問題。近年來，水凝膠以其優(yōu)越的性能如合成簡便、靶向輸送、生物可降解、藥物控釋等特點受到了大量學(xué)者的關(guān)注，成為腫瘤靶向治療的優(yōu)良載體[20]。根據(jù)對外界刺激的反應(yīng)，可分為普通水凝膠和智能水凝膠。普通水凝膠對環(huán)境的變化不敏感，智能水凝膠受到外界刺激凝膠體積及性狀可以發(fā)生改變，包括溫度響應(yīng)型、pH 響應(yīng)型、磁場響應(yīng)型、酶響應(yīng)型等[21-23]。將化療藥物、生物制劑等裝載至水凝膠中可用于腫瘤的治療。局部注射水凝膠不僅可以提高局部藥物濃度，延長藥物與腫瘤細胞作用時間，增強抗腫瘤效果，而且避免對正常組織的損害，降低全身毒性。

早在1998 年，Kraus,S 等報道了23 例皮內(nèi)注射氟尿嘧啶/腎上腺素凝膠(5-FU/EPI/gel)治療頭面頸部、軀干、手臂等表淺部位的鱗癌。每名患者每周注射一次，總共6 周。4 個月后，組織病理學(xué)顯示，23 例中有22 例腫瘤細胞已經(jīng)完全消除，治愈率達到了96%[24]。2003 年，Castro D J 等進行了臨床三期實驗，瘤內(nèi)注射順鉑/腎上腺素凝膠(CDDP/EPI/gel)治療復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性頭頸部鱗狀細胞癌，取得了良好的治療效果[25]。以上說明，瘤內(nèi)注射載藥凝膠治療鱗癌是可行的，可作為非手術(shù)治療的替代方案。

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)是一種細胞外基質(zhì)蛋白酶，因其需要Ca2+、Zn2+等金屬離子作為輔助因子而得名，常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[26]。由于MMPs在惡性腫瘤中常過度表達，經(jīng)常被用作腫瘤標(biāo)志物和治療靶點[15]。在本研究中，我們制備的基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)水凝膠在MMP-2 條件下，藥物釋放加速，體現(xiàn)了良好的MMPs 響應(yīng)特性和緩釋性能(圖5)。同時將光敏劑ICG 包載至基質(zhì)金屬蛋白酶響應(yīng)的水凝膠中，瘤內(nèi)局部注射，避免了靜脈注射引起的全身光毒反應(yīng)，并通過水凝膠的緩釋作用，避免了多次反復(fù)給藥給患者帶來的痛苦。在前期的體外研究中，一系列實驗證實了nano ICG@MMPgel 具有良好的光敏特性和體外抗腫瘤效果。接下來，我們將進一步對其進行體內(nèi)抗腫瘤的研究，以期為舌癌治療提供理論和實驗基礎(chǔ)。