用于飲料中山梨酸鉀快速測定的負壓液芯波導增強拉曼光譜技術研究

初威澄 毛雪飛 劉霽欣 李春生

摘 要：以Teflon-AF材質的液芯波導管為核心部件，構建了負壓液芯波導增強型拉曼檢測系統(tǒng)，可以高效消除液芯光路中液體樣品的氣泡干擾，有效保障液芯波導長光程的拉曼增強作用。在此基礎上，開發(fā)了功能飲料中食品添加劑山梨酸鉀的現(xiàn)場快速檢測方法，最低檢出限（LOD）為0.05g/kg，加標回收率在98%～105%之間。同時，為了進一步降低負壓液芯波導增強型拉曼檢測系統(tǒng)對山梨酸鉀的LOD，本研究利用冷凍富集技術對樣品進一步濃縮，加入20.5g/kg氯化鈉后，經過靜態(tài)冷凍30min、離心冷凍10min的冷凍富集處理，山梨酸鉀的LOD可以達到0.005g/kg，方法的日內和日間穩(wěn)定性（RSD）在3%～4%之間，實際樣品檢測的加標回收率在94%～106%之間。

關鍵詞：負壓;液芯波導增強;山梨酸鉀;功能飲料;冷凍富集

山梨酸鉀是一種高效、低價的防腐劑，常在食品、飲料生產過程中作為食品添加劑使用。在安全用量內攝入山梨酸鉀，不會對人體健康產生影響，但是過量服用可能導致化學性肺炎等問題[1]。我國在GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》中規(guī)定，飲料中山梨酸鉀的含量不得超過0.5g/kg（以山梨酸計）。然而，在實際的食品、飲料生產加工過程中，山梨酸鉀的濫用、過量使用問題時有發(fā)生，這對消費者健康構成了潛在威脅。因此，快速、準確地測定飲料中山梨酸鉀含量，是食品安全檢測工作的重要內容。目前，山梨酸鉀的檢測方法主要有高效液相色譜法[2-3]、紫外分光光度法[4]和分子熒光光譜法[5-6]等，需要耗時、費力的樣品前處理，以及大量的有害試劑，同時使用的儀器體積大、成本高，難以實現(xiàn)快速檢測。

拉曼光譜法是利用拉曼散射效應對與入射光頻率不同的散射光譜進行分析的方法，具有無損耗、快速等優(yōu)點，易于實現(xiàn)儀器的小型化和現(xiàn)場化[7-9]。但是，拉曼散射的強度很弱，通常只有10-10～10-4，這導致拉曼光譜的信號較弱，分析靈敏度低，難以直接用于微量成分的檢測[10]，如傅立葉變換拉曼光譜法、表面增強拉曼光譜法及光纖增強拉曼光譜法等。傅立葉變換拉曼光譜法多使用1 064nm 近紅外激光作為激發(fā)光源[11]，這使得其在很多領域受到了應用限制。表面增強拉曼光譜可以實現(xiàn)數(shù)個數(shù)量級的信號增強[12-13]，如楊宇等[14]檢測山梨酸鉀的檢出限（LOD）為0.180 7g/kg。但是，表面增強方法配比增敏膠體的操作要求較高，且表面增強拉曼光譜的穩(wěn)定性不佳、重現(xiàn)性較差。光纖增強拉曼光譜法是基于全反射原理的拉曼光譜信號增強方式，有光子晶體光纖增強法[15-16]、液芯波導增強法[17-19]等形式，二者的區(qū)別僅在于對應增強器件分別為光子晶體光纖與液芯波導管。其中，液芯波導管的結構簡單、成本較低，而且具有管壁透明、可盤曲性好等特點，在諸多領域得到了應用。但是，光纖增強拉曼光譜法最大的技術瓶頸在于光路中的氣泡會嚴重干擾拉曼光的傳播[20-21]，而這在溶液樣品進樣過程中是極難避免的，這極大阻礙了光纖增強拉曼光譜技術在實際樣品分析中的應用。

另外，為了進一步降低拉曼光譜技術在實際檢測時的LOD，常對液體樣品中的待測物質進一步濃縮處理。其中，冷凍濃縮是近年來發(fā)展迅速的一種富集方式，其原理是利用稀溶液與冰在冰點以下的固液相平衡關系來實現(xiàn)富集[22-24]。由于該技術在低溫常壓下操作，分子物質不易分解，綠色、無污染，同時可以添加氯化鈉（NaCl）等鹽類促進待測組分從冰中析出，進一步提高預富集倍數(shù)[25]。

針對上述問題，本研究構建了新型的負壓拉曼光譜檢測系統(tǒng)，以Teflon-AF材質的液芯波導管為核心部件，并利用管壁材質的通透性，通過管外負壓來消除內管氣泡干擾，以達到現(xiàn)場快速檢測的目的。同時配合車載冰箱，以冷凍濃縮方法對待測樣品進行富集，對低濃度的樣品進行檢測，研究市售功能飲料中山梨酸鉀含量的定量檢測方法，提供一種車載實驗室的快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山梨酸鉀標準物質（純度99.0%），北京世紀奧科生物有限公司;5種功能飲料，購買于北京;超純去離子水（TTL-30B型超純水儀），北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司;NaCl（純度為99.0%），北京華奧寶生科技有限公司;乙二醇（純度為96.0%），北京百靈威科技有限公司;實驗中所用溶液在進入檢測平臺之前均經濾膜（0.22μm，津騰針式過濾器）過濾后進行上機檢測。

1.2 儀器與設備

激光器（Laser785-5HSB），上海如海光電科技有限公司;檢測探頭（RPB-785-1.5-SS），上海如海光電科技有限公司;拉曼光譜儀（KIT21），美國Ocean Optics Inc公司;液芯波導管（Teflon AF 2400，長度20cm、外徑406μm、內徑229μm），美國DuPont公司;車載冰箱（-18℃），德國Alpicool公司;小型離心機（Mini Centriguge 7000），美國SCILOGEX公司。

1.3 負壓拉曼檢測系統(tǒng)

檢測系統(tǒng)如圖1所示，激光器的激發(fā)波長為785 nm，激光通過檢測探頭聚焦于液芯波導管端口，通過進樣程序控制電磁閥1、電磁閥2和真空泵的工作狀態(tài)，利用負壓將待測樣品導入液芯波導管（液體流向如圖1箭頭所示，詳細流程見表1），之后利用真空泵進行負壓脫氣檢測，背散射方式由同一檢測探頭采集待測物質激發(fā)產生的拉曼光譜信號，并傳送至拉曼光譜儀進行數(shù)據(jù)記錄和分析。檢測完成后，檢測溶液流入廢液瓶中。

1.4 樣品的冷凍富集

取8 mL功能飲料樣品，加入設定量的NaCl;采用同樣的方法，以水為基質配制空白溶液，并配置不同山梨酸鉀含量的標準溶液。待NaCl完全溶解后，將溶液移入1.5 mL離心管中，為防止因冷凍時體積膨脹擠破管蓋，每個離心管中僅加入1mL溶液。首先，將各溶液浸入預冷凍4 h以上（-18℃車載冰箱）的乙二醇中進行靜態(tài)冷凍，靜態(tài)冷凍一定時間后，將離心管轉入放置在車載冰箱中的小型離心機中進行冷凍離心，經過一定時間后，立即取出離心管并刺破離心管底部，使富集后的溶液流入檢測后的檢測試管中。

1.5 光譜采集

樣品通過負壓拉曼進樣系統(tǒng)導入后進行檢測，激光器和拉曼光譜信號采集參數(shù)為：激光功率為500 mW，采集積分時間為1s（n=1），采集的拉曼光譜曲線經背景的扣除后，再對光譜數(shù)據(jù)進行平滑處理并測量其峰高和峰面積。

2 結果與分析

2.1 負壓力與信號穩(wěn)定時間

由于液芯波導管直接導入液體樣品時存在氣泡干擾，因此，本研究的液芯波導系統(tǒng)依靠真空泵產生的負壓力來實現(xiàn)待測樣品的脫氣，實現(xiàn)有效和穩(wěn)定的檢測。為了提高檢測效率，在最短時間內實現(xiàn)脫氣檢測，需要優(yōu)化液芯波導系統(tǒng)的負壓值。本工作在導入0.5g/kg的山梨酸鉀標準溶液后，控制第三步脫氣段（表1）真空泵的負壓參數(shù)，以測試不同負壓值條件下山梨酸鉀溶液信號達到穩(wěn)定所需的時間。

由圖2可知，當負壓的絕對值降低時，信號穩(wěn)定所需的時間增長，這與液芯波導管脫氣的原理是一致的;當壓力值在-20k～-60kPa時，平衡時間隨壓力的降低而顯著減少;當壓力值在-60k～-90kPa時，這一趨勢明顯變緩;當壓力值小于-90kPa時，穩(wěn)定時間變化較小?？紤]到檢測系統(tǒng)中的液芯波導管的壁厚為177μm，機械強度較低，為避免檢測過程中液芯波導管結構產生形變，最終選擇負壓環(huán)境為-90kPa。

2.2 山梨酸鉀拉曼特征位移的確定

拉曼光譜能夠得到待測分子的振動信息，因為不同的化學鍵對應著不同的振動方式，因此產生了不同的拉曼光譜。在利用拉曼光譜對山梨酸鉀進行定量分析之前，需要確定山梨酸鉀的拉曼特征峰，用于定性分析。配制濃度為0、0.25、0.50、1.25、2.50、5.00、10.0、20.0、40.0g/kg的山梨酸鉀標準溶液，兩次檢測間隔僅為5min。從圖3可以看到，山梨酸鉀拉曼光譜信號主要集中在1 100～1 800 cm-1內，其中1 143、1 278、1 381、1 637 cm-1位移處有特征峰出現(xiàn)，并隨著濃度的變化呈線性規(guī)律變化，因此可以作為山梨酸鉀的特征拉曼位移。雖然在其他位置也有拉曼特征峰出現(xiàn)，但由于信噪比較低，并不適用于實際分析;相比之下，在1 637 cm-1位移處特征峰的信噪比最高，最終選擇1 637cm-1為定量分析的特征拉曼位移。

2.3 靜態(tài)冷凍時間對冷凍富集的影響

冷凍富集可以有效地提高進樣溶液中待測物質的溶度，從而提高方法的最低檢出能力。為了提高檢測效率，縮短樣品處理時間，本研究對山梨酸鉀溶液樣品的冷凍富集條件進行了優(yōu)化。首先，將待測樣品直接進行靜態(tài)冷凍，結果表明，冷凍時間在40min左右時待測樣品可被完全凍結，基本無液體剩余，無法達到富集的效果。另一方面，參考NaCl和水的相圖[15]，當水溶液中存在一定濃度的NaCl時，可以有效地避免溶液被完全凍結，故又加入20.5g/kg的NaCl后按上文方法進行冷凍實驗，結果確實有部分溶液未被凍結，但這些溶液主要被封存在冰塊的間隙中，難以取出，無法進行后續(xù)檢測。

為了進一步解決這一問題，本研究考慮對待測樣品依次進行靜態(tài)冷凍和的離心冷凍，通過離心力使冰塊始終凍結在溶液上方，并對其時間進行了優(yōu)化。具體操作為：向待測溶液中加入一定量的NaCl，待測山梨酸鉀溶液的濃度為0.5g/kg，分別經0、10、20、30、40min的靜態(tài)冷凍，再經過離心冷凍至達到固液平衡，結果顯示，上述不同靜態(tài)冷凍時間下對應的離心冷凍時間分別為>4 h、1h、30min、10min、0min，說明靜態(tài)冷凍由于熱傳遞更為充分，冷凍速度更快。但當靜態(tài)冷凍時間為40min時，離心管內部幾乎完全被冰填滿，富集后的溶液完全被封存在冰塊的間隙中，不便取出，故冷凍最終階段使用離心冷凍以防止富集后溶液無法取出;而靜態(tài)冷凍時間小于30min時，整個處理的時間較長。綜合考慮冷凍效果和處理時間，最終選擇30min左右的靜態(tài)冷凍和10min離心冷凍處理。對靜態(tài)冷凍時間做了進一步優(yōu)化（靜態(tài)冷凍時間分別為24、27、30、33、36min，離心冷凍時間為10min），同時采用ICP-OES檢測富集前后鈉離子的濃度比，以驗證溶液的冷凍富集倍數(shù)，再通過本研究中使用的負壓液芯波導增強型拉曼檢測系統(tǒng)驗證山梨酸鉀的富集倍數(shù)，最后，計算富集前后溶液的體積比并與兩種富集倍數(shù)相比較，以尋求一個簡單的富集倍數(shù)計算方法。由圖4可知，靜態(tài)冷凍時間在24～30min時，各項比值均隨靜態(tài)冷凍時間的增加而增大，說明在這段時間內，尚未達到NaCl濃溶液和冰的平衡點;在30～33min時，各項比值基本趨于穩(wěn)定，而且NaCl含量接近該溫度下的飽和濃度，證明在這段時間內達到了NaCl濃溶液和冰的平衡點，其中30min時各項比值相差較小，證明靜態(tài)冷凍為30min時可以用富集前后的液體的體積比代替山梨酸鉀溶液的濃度富集倍數(shù)。靜態(tài)冷凍為36min時，雖然體積比很大，但是鈉離子富集倍數(shù)與山梨酸鉀富集倍數(shù)與之相差很多，可能是已經有部分液體被封存在冰塊中所造成的。因此，最終選擇靜態(tài)冷凍時間為30min、離心冷凍時間為10min。

2.4 氯化鈉濃度對富集前后的濃度比的影響

待測樣品中NaCl的濃度（CNaCl）對溶液的富集倍數(shù)（Ck）有一定的影響，其原理可從NaCl與水的相圖中得知。如圖5所示，在相同溫度下，NaCl的含量越高，溶液中冰的比例就越少，即富集倍數(shù)越低。本研究取5種待測功能飲料樣品，山梨酸鉀的加標濃度為0.5g/kg，加入不同量的NaCl配制成混合溶液（NaCl濃度分別為11.7、14.6、17.6、20.5、23.4g/kg）。使用負壓液芯波導拉曼光譜系統(tǒng)測定上述處理溶液中山梨酸鉀的含量。由圖5可知，待測樣品中NaCl的濃度越大冷凍富集倍數(shù)越小。當待測溶液中NaCl濃度為20.5g/kg時，富集倍數(shù)在10倍左右;而NaCl濃度小于20.5g/kg時，雖然富集倍數(shù)較高，但是富集后剩余液體量過少（少于600μL），溶液取出困難，因此不予選擇。各檢測溶液的富集濃度比存在一定差異的原因可能是待測溶液中含有不同量的碳水化合物等物質，同樣會影響溶液冰點。因此，實驗中NaCl濃度在-18℃冷凍時略小于NaCl和水的相圖[15]中所對應的濃度數(shù)值（圖5中1mol/L對應58.5g/kg）。最終選擇在待測溶液富集前添加20.5g/kg的NaCl作為處理條件。

2.5 方法檢出限

依據(jù)圖3計算冷凍富集前的工作曲線，由于1 637 cm-1處信噪比最高，故選取該波數(shù)作為定量分析的拉曼光譜位移數(shù)。按照公式3Sb/k計算LOD[3]，其中Sb為測定11次試劑空白所得到數(shù)值的標準偏差，k為標準曲線線性方程的斜率。最終，得到該位移處的儀器檢出限為0.05g/kg，標準曲線（山梨酸鉀濃度分別為0、0.05、0.1、0.5、1g/kg）的R2為0.998 9，其檢測的拉曼光譜信號如圖2所示?？紤]到10倍的富集系數(shù)，冷凍富集方法的LOD為0.005g/kg，按照冷凍富集前處理的標準曲線R2為0.990 8。

2.6 方法重現(xiàn)性

穩(wěn)定性是評價檢測方法可靠性的重要指標，本研究測定1 637 cm-1特征位移值下0.5g/kg山梨酸鉀溶液，并按照冷凍富集的實驗方法以及優(yōu)化后的參數(shù)操作，連續(xù)7次進樣，以評價方法的7d的日內穩(wěn)定性，計算其RSD分別為2.8%、2.3%、2.5%、3.2%、2.9%、3.0%、2.8%，從而證明該方法在對山梨酸鉀檢測時，具有良好的重復性。對日間穩(wěn)定性進行評估，取每日7組實驗的平均值，同樣以波數(shù)為1 637 cm-1處的特征峰為檢測對象，計算日間重復性RSD為4.0%。表2結果表明，冷凍富集負壓液芯波導拉曼光譜法測定山梨酸鉀具有較好的重現(xiàn)性。

2.7 加標回收率

本研究對5種功能飲料（標號1～5）并以國家標準限量值（0.5g/kg）進行加標回收檢測，按照實驗方法與上文優(yōu)化后的實驗參數(shù)檢測待測溶液，并以1 637 cm-1的特征峰為檢測對象。由表3可知，經過冷凍富集的樣品的回收率在94%～106%之間，未經過冷凍富集的樣品的回收率在98%～106%之間，表明直接進樣或者經冷凍富集后的負壓液芯波導拉曼光譜法，對真實飲料樣品中山梨酸鉀含量的測定具有良好的準確度。

3 結論

本研究以Teflon-AF材質的液芯波導管為核心部件，構建了負壓液芯波導增強型拉曼檢測系統(tǒng)，可以快速高效地消除液芯光路中液體樣品的氣泡干擾，有效保障液芯波導長光程的拉曼增強作用。在此基礎上，開發(fā)了功能飲料中食品添加劑山梨酸鉀的現(xiàn)場快速篩查方法，直接進樣檢測山梨酸鉀的最低LOD為0.05g/kg，加標回收率在98%～106%之間。同時，為了進一步降低負壓液芯波導增強型拉曼檢測系統(tǒng)對山梨酸鉀的LOD，本研究利用冷凍富集技術對樣品進一步濃縮，加入20.5g/kg NaCl后，經過靜態(tài)冷凍30min、離心冷凍10min的冷凍富集處理，山梨酸鉀的LOD可以達到0.005g/kg，方法的日內和日間穩(wěn)定性（RSD）在3%～4%之間，實際樣品檢測的加標回收率在94%～106%之間。本研究首次將負壓液芯波導增強型拉曼光譜分析技術應用于山梨酸鉀的實際樣品分析，可以快速測定功能飲料樣品中山梨酸鉀的含量，既滿足了現(xiàn)場快速篩查的需要，也可以實現(xiàn)低含量樣品的準確分析，將為市場環(huán)節(jié)中食品添加劑的食品安全監(jiān)管工作提供一種快速、有效、可靠的分析技術手段。

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Abstract：A liquid core waveguide made of Teflon-AF was used as the core component.A negative pressure liquid core waveguide enhanced Raman detection system was constructed，which could quickly and efficiently eliminate the bubble interference of liquid samples in the liquid core optical path and effectively guarantee the liquid core waveguide Raman enhancement of long light path.Based on this，a rapid on-site detection method for potassium sorbate as a food additive in functional beverages was developed.The minimum detection limit （LOD）was 0.05g/kg，and the standard recovery was 98%～105%.At the same time，in order to further reduce the LOD of potassium sorbate in the negative pressure liquid core waveguide enhanced Raman detection system，the sample was further concentrated by freezing enrichment technology.After adding 20.5g/kg sodium chloride，the sample was frozen for 30min.After centrifuging and freezing for 10min，the LOD of potassium sorbate could reach 0.005g/kg，and the intra-day and inter-day stability （RSD）of the method was 3%～4%.The spiked recovery of the actual sample detection was 94%～106%.

Keywords：negative pressure;liquid core waveguide enhancement raman spectroscopy;potassium sorbate;functional beverage;freezing pre-concentration

（責任編輯 唐建敏）