藥用石斛內(nèi)生菌的研究進(jìn)展

王珊珊 劉佳萌 孫晶 賈寧 范蓓 戴小楓

摘?要：綜述了藥用石斛內(nèi)生菌的分離鑒定以及與宿主互作關(guān)系等方面的國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展。在介紹藥用石斛內(nèi)生真菌、內(nèi)生細(xì)菌的基礎(chǔ)上，結(jié)合本課題組前期對(duì)石斛內(nèi)生細(xì)菌做出的相關(guān)研究工作，對(duì)其研究發(fā)展思路進(jìn)行了展望，為開(kāi)發(fā)安全有效的微生物菌肥、中醫(yī)藥產(chǎn)品、新資源功能性食品，合理利用藥用石斛資源提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：藥用石斛;內(nèi)生真菌;內(nèi)生細(xì)菌

石斛（Dendrobium）屬蘭科植物，全球現(xiàn)存約1 500種，其中僅中國(guó)華南及西南地區(qū)就分布有近80種。石斛不僅聞名于其較好的觀賞性，許多種類還具有極高的藥用價(jià)值，中國(guó)石斛屬植物已超過(guò)50余種被認(rèn)定為有藥用價(jià)值[1]。本文將藥典里已有明確規(guī)定用作藥用、傳統(tǒng)用作藥用、相關(guān)研究證明具有藥用療效的石斛統(tǒng)稱為藥用石斛。在我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，石斛屬多種植物的新鮮或干燥莖被收做藥用，具有極高的藥用價(jià)值，如鐵皮石斛（Dendrobium offcinale）、霍山石斛（Dendrobium huoshanense）、金釵石斛（Dendrobium nobile）和流蘇石斛（Dendrobium fimbriatum）等[2]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》最早對(duì)石斛記錄其 “味甘，平。主傷中;除痹，下氣，補(bǔ)五臟虛勞羸瘦，強(qiáng)陰。久服厚腸胃;輕身延年”，其被歷代醫(yī)家視為珍品，民間甚至稱其為 “九大仙草”之一[3]。據(jù)2015版《中國(guó)藥典》記載，石斛味甘，微寒;歸胃、腎經(jīng)。益胃生津，滋陰清熱，用于熱病津傷，口干煩渴，胃陰不足，食少干嘔，病后虛熱不退，陰虛火旺，骨蒸勞熱，目暗不明，筋骨痿軟[4]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)的大量研究表明，石斛中含有豐富的氨基酸、生物堿、多糖、酚類等活性成分，具有很好的降血糖、抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、提高免疫等功效[5]。研究表明，藥用植物與眾不同的次級(jí)活性代謝物極有可能與其相關(guān)微生物群落的高特異性有關(guān)[6]。一些從藥用植物中分離出的特定內(nèi)生菌可產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的活性功能，或者對(duì)藥用植物的一些致病菌具有較好的抑制效果[7-8]。國(guó)內(nèi)外研究人員在藥用石斛內(nèi)生菌的分離鑒定以及與宿主互作關(guān)系等方面已作了一些相關(guān)的研究。藥用石斛在其生活史中與內(nèi)生菌經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化，彼此構(gòu)成了穩(wěn)定的生態(tài)關(guān)系。藥用石斛內(nèi)生菌分泌的次級(jí)活性代謝物會(huì)對(duì)石斛的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生刺激作用，進(jìn)而提高宿主石斛對(duì)生物脅迫以及非生物脅迫的抵抗能力;與此同時(shí)，內(nèi)生菌也可從宿主石斛中吸取養(yǎng)分以供自身生長(zhǎng)所需。本文對(duì)藥用石斛內(nèi)生菌進(jìn)行綜述，為開(kāi)發(fā)出安全有效的微生物菌肥、中醫(yī)藥產(chǎn)品、新資源功能性食品，合理的利用寶貴藥用石斛資源提供科學(xué)依據(jù)，并針對(duì)該領(lǐng)域存在的主要問(wèn)題提出解決方案。

1?藥用石斛內(nèi)生真菌

1.1?藥用石斛內(nèi)生真菌研究概況

近年來(lái)，內(nèi)生真菌因其較為豐富的生物組成多樣性及次生代謝產(chǎn)物多樣性，已成為尋找具有生物活性成分的重要來(lái)源，并引起眾多研究者的關(guān)注。目前，已有對(duì)以下藥用石斛內(nèi)生真菌進(jìn)行研究的報(bào)道：鐵皮石斛（Dendrobium offcinale）、霍山石斛（Dendrobium huoshanense）、美花石斛（Dendrobium loddigesii）、金釵石斛（Dendrobium nobile）、細(xì)莖石斛（Dendrobium moniliforme）、齒瓣石斛（Dendrobium devonianum）、束花石斛（Dendrobium chrysanthum）、流蘇石斛（Dendrobium fimbriatum）和華石斛（Dendrobium sinense）等少數(shù)具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的種類。其他品種石斛涉及較少，對(duì)內(nèi)生真菌與宿主石斛互作機(jī)理的研究也鮮有報(bào)道[9-18]。藥用石斛內(nèi)生真菌的種群存在豐富的多樣性，其主要分為三大門類：子囊菌亞門（Ascomycota）、擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina）和半知菌亞門（Deuteromycotina），包括炭角菌科（Xylariaceae）、傘菌科（Agaricaceae）以及叢梗孢科（Moniliaceae）等約25個(gè)科，小菇屬（Mycena）、木霉屬（Trichoderma）以及柱孢霉屬（Cylindrocarpon）等約57個(gè)屬[19-21]。雖然已經(jīng)分離鑒定出的藥用石斛內(nèi)生真菌種類相對(duì)較多，但對(duì)比于豐富的藥用石斛資源來(lái)說(shuō)，內(nèi)生真菌多樣性的研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。

藥用石斛內(nèi)生真菌在宿主中的分布存在特異性。前人研究表明，藥用石斛內(nèi)生真菌的分布受組織、宿主、環(huán)境等因素的影響，進(jìn)而體現(xiàn)出一定的組織、宿主、生境特異性。洪群艷等 [22]通過(guò)組織分離法對(duì)從云南采集到的8種野生石斛中的內(nèi)生真菌進(jìn)行分離、鑒定以及分布組成研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同種的石斛內(nèi)生真菌分布情況具有較大差異，呈現(xiàn)出一定的宿主特異性;根、莖、葉中內(nèi)生真菌的分布差異性也極其顯著，說(shuō)明內(nèi)生真菌定殖具有組織特異性。毛益婷等[23]對(duì)采集自湖南省新寧縣崀山、廣西省樂(lè)業(yè)縣雅長(zhǎng)兩個(gè)不同生境下，相同生長(zhǎng)期鐵皮石斛根組織中的內(nèi)生真菌進(jìn)行分離、鑒定，結(jié)果表明，雅長(zhǎng)野生鐵皮石斛內(nèi)生真菌多樣性明顯高于崀山。其中，膠膜菌屬（Tulasnella）和柱孢霉屬（Cylindrosporium）為崀山所特有，擬盤多孢霉（Pestalotiopsis）為雅長(zhǎng)所特有。由此可見(jiàn)，不同生境下野生鐵皮石斛內(nèi)生真菌的多樣性存在一定的特異性。陳玉棟等[24]、胡克興等[25]、董飛[26]研究表明，鐵皮石斛根部和莖部的內(nèi)生真菌豐富度要明顯高于葉片，特別是在根中內(nèi)生真菌資源最為豐富。陳曉梅等[10]研究表明，美花石斛根部?jī)?nèi)生真菌多樣性明顯高于莖和葉，此結(jié)果與鐵皮石斛相一致。然而，柴曉蕾等[11]對(duì)海南華石斛野生植株內(nèi)生真菌的研究結(jié)果表明，葉中分離出的菌株數(shù)最多。由此可見(jiàn)，不同品種的藥用石斛內(nèi)生真菌的分布以及數(shù)量存在一定的差異性，也或是因?yàn)槟壳岸嗖捎媒M織分離法進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離，其中的分離培養(yǎng)基、消毒程序、人為操作、培養(yǎng)條件等因素也會(huì)造成菌株分離結(jié)果的差異。內(nèi)生真菌與宿主的互作關(guān)系研究甚少，尚不明朗，多為推論性或間接性的結(jié)果。因此，在未來(lái)的藥用石斛內(nèi)生真菌的研究中，可通過(guò)結(jié)合高通量測(cè)序等DNA分析技術(shù)，例如構(gòu)建不同品種藥用石斛內(nèi)生真菌的cDNA文庫(kù)等，快速篩選內(nèi)生真菌。

1.2?研究藥用石斛內(nèi)生真菌的重要性

1.2.1?內(nèi)生真菌對(duì)藥用石斛種子萌發(fā)以及植株生長(zhǎng)的影響?現(xiàn)有研究表明，內(nèi)生真菌在藥用石斛的生長(zhǎng)發(fā)育和系統(tǒng)演化過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。黃暉等[9]采用單菌絲團(tuán)分離法對(duì)齒瓣石斛根組織中的內(nèi)生真菌進(jìn)行分離、鑒定，共得到內(nèi)生真菌6株，將其分別與齒瓣石斛無(wú)菌幼苗共生培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)DdS-5菌株對(duì)幼苗株高、干重、鮮重、根數(shù)和莖粗都表現(xiàn)出顯著的促進(jìn)效果，F(xiàn)DdS-9菌株只對(duì)無(wú)菌苗的株高具有顯著的促進(jìn)作用。隨后，孟娉等[27]利用注射器接種法分別將上述兩種菌株的單一菌劑以及混合菌劑注射接種到松樹(shù)皮基質(zhì)上與鐵皮石斛幼苗進(jìn)行共生培養(yǎng)，結(jié)果表明，F(xiàn)DdS-5和FDdS-9均能對(duì)鐵皮石斛幼苗生長(zhǎng)表現(xiàn)出顯著的促進(jìn)作用。同時(shí)，混合菌劑接種組與單菌株接種組相比，對(duì)石斛幼苗生長(zhǎng)的協(xié)同效應(yīng)更加明顯。由此可見(jiàn)，齒瓣石斛的促生真菌同樣能對(duì)鐵皮石斛幼苗的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，混合接種可能會(huì)更大地發(fā)揮微生物的效能。近幾年來(lái)，已有相關(guān)研究陸續(xù)報(bào)道了內(nèi)生真菌對(duì)鐵皮石斛、金釵石斛、齒瓣石斛、兜唇石斛、華石斛、霍山石斛、美花石斛和細(xì)莖石斛等具有促生作用[17，28-31]。關(guān)于藥用石斛內(nèi)生真菌對(duì)宿主的促生機(jī)制已有相關(guān)的研究報(bào)道。馬昭[32]初步研究了具有促生作用的內(nèi)生真菌對(duì)鐵皮石斛轉(zhuǎn)錄水平的影響，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌感染鐵皮石斛無(wú)菌苗后宿主植物在一系列代謝途徑上均發(fā)生了基因差異表達(dá)。其中，NT66G01、NT04Y01兩菌株具有使宿主植物生長(zhǎng)相關(guān)代謝通路基因表達(dá)明顯上調(diào)的作用。X B Xu等[33]利用二維電泳和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）鑒定了與石斛小菇共生栽培的鐵皮石斛根系蛋白，共鑒定出41種被石斛小菇誘導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。其中，10種參與了植株的防御和應(yīng)激反應(yīng)、2種參與了根系的形成、3種參與了宿主植物活性成分的生物合成。趙英梅[34]對(duì)石斛小菇侵染金釵石斛前后基因水平的變化進(jìn)行了初步探索，發(fā)現(xiàn)CI-通道蛋白、生長(zhǎng)素跨膜蛋白、肽合成酶合成代謝途徑的一些重要基因，比如Unigene65712、Unigene65407、Unigene68656等上調(diào)倍數(shù)達(dá)到15倍以上，推測(cè)可能參與了石斛菌根的建立過(guò)程。雖然已有大量研究表明，藥用石斛內(nèi)生真菌能促進(jìn)宿主植株的種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)，但還需要研究者對(duì)藥用石斛與內(nèi)生真菌之間的共生機(jī)理研究透徹，以便為開(kāi)發(fā)出綠色安全的微生物菌肥以及藥用石斛的仿生態(tài)栽培提供理論技術(shù)支持，從而更好地利用寶貴的藥用石斛資源。

1.2.2?內(nèi)生真菌對(duì)藥用石斛化學(xué)成分和藥理活性的影響?自Stierle A等[35]從植物內(nèi)生真菌中發(fā)現(xiàn)抗癌藥物紫杉醇以來(lái)，內(nèi)生真菌作為一種新的天然產(chǎn)物和生物活性物質(zhì)的重要來(lái)源而備受關(guān)注。研究表明，內(nèi)生真菌在與藥用石斛互相依存的過(guò)程中，會(huì)對(duì)藥用石斛的化學(xué)成分以及藥理活性產(chǎn)生一定的影響。內(nèi)生真菌對(duì)藥用石斛化學(xué)成分和藥理活性的影響主要從以下兩種途徑進(jìn)行：（1）內(nèi)生真菌可刺激宿主植物的代謝活動(dòng)，進(jìn)而提高其次級(jí)代謝產(chǎn)物的含量，增強(qiáng)其藥用效果。陳曉梅等[36]研究表明，在內(nèi)生真菌與金釵石斛共生培養(yǎng)條件下，不僅能促進(jìn)金釵石斛的生長(zhǎng)，而且還能提高金釵石斛總生物堿和多糖的含量。羅在柒等[37]測(cè)定了3株內(nèi)生真菌的分泌物對(duì)金釵石斛超氧化物歧化酶（SOD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）和氧化物酶（POD）活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這3株內(nèi)生真菌分泌物均能誘導(dǎo)金釵石斛的酶活性增強(qiáng)。趙英梅[34]在對(duì)石斛內(nèi)生真菌互作分子機(jī)理的研究中發(fā)現(xiàn)，其共生體系能促進(jìn)金釵石斛組培苗生物量的積累。（2）內(nèi)生真菌自身或可產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的藥用活性產(chǎn)物。Sujit Shah等[17]對(duì)從細(xì)莖石斛中分離出的內(nèi)生真菌進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，R10能產(chǎn)生相對(duì)較高的吲哚乙酸（IAA）。同時(shí)，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）在R11和R6的有機(jī)提取物中觀察到酚類化合物和揮發(fā)油的存在，推測(cè)它們或許對(duì)寄主植物的抗菌和抗氧化性具有一定的影響。

1.2.3?藥用石斛內(nèi)生真菌的抗菌活性?已有相關(guān)研究表明，藥用石斛內(nèi)生真菌對(duì)一些石斛病原菌具有很好的抑制效果，是獲取天然抗菌活性物質(zhì)的有效途徑。張麗春等[38]從5 種云南產(chǎn)石斛屬植物中分離得到內(nèi)生真菌155 株，其中48 株真菌對(duì)枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等6種病原菌中的至少1種具有抑制效果。周琢艷等[39]通過(guò)抑菌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，分離自鐵皮石斛的28 株內(nèi)生真菌中，有7 株能對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌中的至少1 種表現(xiàn)出抗菌活性，其代謝產(chǎn)物的醋酸乙酯萃取相對(duì)3種指示菌及人肝癌細(xì)胞HepG2具有不同程度的抑制效果。除此之外，還有不少研究已證實(shí)，從藥用石斛植物中分離得到的內(nèi)生真菌對(duì)多種病原菌呈現(xiàn)出良好的抗菌活性[11，26，30，40]。盡管這些內(nèi)生真菌的抗菌活性成分以及作用機(jī)制尚不明確，但不可否認(rèn)的是，這為今后獲得天然抗菌活性物質(zhì)和研發(fā)新型抗生素藥物提供了寶貴的真菌資源。

1.2.4?藥用石斛內(nèi)生真菌的其他作用?隨著現(xiàn)代科學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展，對(duì)于藥用石斛內(nèi)生真菌的研究已擴(kuò)展到了其他各個(gè)研究領(lǐng)域，內(nèi)生真菌的作用也正在被一步步挖掘出來(lái)。劉小莉等[41]從石斛中分離得到一株內(nèi)生禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）DO-1，其菌體在去離子水中浸泡后分泌的代謝產(chǎn)物與硝酸銀作用后，能還原銀離子產(chǎn)生具有抗菌作用的納米銀粒子。相子春[42]對(duì)從藥用植物鐵皮石斛根組織中分離出的一株瘤菌根菌屬（Epulorhiza sp.）真菌M1進(jìn)行細(xì)胞毒理性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其可以顯著降低感染細(xì)胞內(nèi)的HIV-1 RNA含量，且M1對(duì)HIV-1感染的作用位點(diǎn)是在逆轉(zhuǎn)錄后到HIV RNA表達(dá)之前，為一類新型的具有調(diào)節(jié)HIV-1基因表達(dá)作用的藥物。Ling-Shang Wu等[43]從鐵皮石斛內(nèi)生真菌DO14代謝產(chǎn)物中分離到對(duì)人癌細(xì)胞（LOVO細(xì)胞、HL-60細(xì)胞）具有不同程度抑制效果的5種化合物。劉維等[44]研究發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛內(nèi)生真菌H1B1可產(chǎn)生適用于高糖高鹽環(huán)境的水溶性胞外紅色素，是天然功能色素的潛在來(lái)源之一。由此可見(jiàn)，藥用石斛內(nèi)生真菌具有巨大的應(yīng)用潛能，亟需科研人員對(duì)其進(jìn)行多方面、多廣度、深層面的研究。

2?藥用石斛內(nèi)生細(xì)菌

2.1?藥用石斛內(nèi)生細(xì)菌研究概況

對(duì)藥用石斛內(nèi)生菌的研究開(kāi)始于內(nèi)生真菌，近年來(lái)對(duì)內(nèi)生細(xì)菌也開(kāi)始了陸續(xù)的研究，但多采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)基篩選法。現(xiàn)將已分離鑒定得到的可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行了整理匯總，包括放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes），包括芽孢桿菌科（Bacillacea）、伯克氏菌科（Burkholderiaceae）以及假單胞菌科（Pseudornonadaceae）等約27個(gè)科，芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞桿菌屬（Pseudomonas）以及賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus）等約40多個(gè)菌屬[45-56]。傳統(tǒng)的篩菌方法通常只能篩選到約1%的內(nèi)生細(xì)菌，這不利于內(nèi)生細(xì)菌的綜合研究。近年來(lái)，分子生物學(xué)方法已經(jīng)在藥用石斛內(nèi)生細(xì)菌的鑒定上開(kāi)始應(yīng)用。Cong Pei等[47]利用傳統(tǒng)的內(nèi)生菌分離法、聚合酶鏈反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）和宏基因組方法對(duì)鐵皮石斛的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行比較分析研究。結(jié)果表明，在內(nèi)生細(xì)菌鑒定方面，傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法存在一定的局限性;PCR-DGGE方法可以給出較詳細(xì)的結(jié)果;而宏基因組方法可以提供完整透徹的分析。本課題組前期通過(guò)結(jié)合微生物多樣性分析（MiSeq高通量測(cè)序）及傳統(tǒng)的內(nèi)生菌分離法對(duì)分別采集自中國(guó)湖北省英山縣和中國(guó)安徽省霍山縣的米斛（Dendrobium huoshanense）、銅皮（Dendrobium moniliforme）、鐵皮（Dendrobium officinale）等6個(gè)不同種的石斛莖內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分析研究。結(jié)果表明，從門水平上看，微生物多樣性測(cè)序分析檢測(cè)到了傳統(tǒng)的內(nèi)生菌分離法未檢測(cè)到的擬桿菌門（Bacteroidetes）;從屬水平上看，傳統(tǒng)的內(nèi)生菌分離法分離得到20個(gè)菌屬，而微生物多樣性測(cè)序分析得到373個(gè)菌屬，其中15個(gè)菌屬的相對(duì)豐度超過(guò)1%。同時(shí)，傳統(tǒng)的內(nèi)生菌分離法分離得到的菌屬都已被發(fā)表報(bào)道過(guò)，而微生物多樣性測(cè)序分析可以檢測(cè)到未被報(bào)道過(guò)的從石斛中分離出的一些菌屬，比如羅爾斯通菌屬（Ralstonia）、叢毛單胞菌屬（Comamonas）以及Lelliottia[48]。因此，有必要使用多相方法來(lái)對(duì)“可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)的內(nèi)生菌”進(jìn)行全面的分析研究。

藥用石斛內(nèi)生細(xì)菌在宿主中的分布與內(nèi)生真菌類似，也存在一定的組織、宿主、生境特異性。本課題通過(guò)微生物多樣性分析（MiSeq高通量測(cè)序）對(duì)英山米斛、英山銅皮、英山鐵皮以及霍山米斛、霍山銅皮、霍山鐵皮6個(gè)不同品種、不同產(chǎn)地的石斛莖組織內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行了比較分析。結(jié)果表明，石斛莖組織內(nèi)生細(xì)菌組成及相對(duì)豐度具有宿主、生境特異性：從品種來(lái)看，鐵皮大于銅皮，米斛內(nèi)生細(xì)菌菌群豐富度最小;從產(chǎn)地來(lái)看，霍山石斛內(nèi)生細(xì)菌菌群多樣性明顯高于英山石斛，而且產(chǎn)地差異對(duì)藥用石斛內(nèi)生細(xì)菌菌群的影響高于品種差異，這也側(cè)面反映了藥材的道地性[48]。王明月等[51]對(duì)人工種植2 年的鐵皮石斛根、莖和葉中的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離、鑒定，結(jié)果表明，鐵皮石斛根組織中分布的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量明顯高于莖和葉，其中蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）和格氏沙雷氏菌（Serratia grimesii）只在根中分離鑒定得到，進(jìn)而推測(cè)土壤或許是鐵皮石斛中內(nèi)生細(xì)菌的重要來(lái)源;同時(shí)，鐵皮石斛不同部位的內(nèi)生細(xì)菌菌群組成存在一定的差異性，菌群種數(shù)為根>莖>葉。吳慶珊等[46]采用9 種不同培養(yǎng)基對(duì)采集自3個(gè)不同產(chǎn)地的金釵石斛根組織、莖組織和葉組織中的內(nèi)生細(xì)菌分離、鑒定，結(jié)果表明，金釵石斛內(nèi)生細(xì)菌的組成多樣性受其產(chǎn)地和組織的影響。在3個(gè)樣地的金釵石斛中，P1 樣地的金釵石斛內(nèi)生細(xì)菌豐富度指數(shù)Margalef明顯高于P2、P3 樣地，芽孢桿菌屬（Bacillus）和短芽孢桿菌屬（Brevibacillus）為3 個(gè)不同產(chǎn)地金釵石斛內(nèi)生細(xì)菌中的優(yōu)勢(shì)菌屬;其中，根部?jī)?nèi)生細(xì)菌菌株最多，其內(nèi)生細(xì)菌豐富度指數(shù)Margalef（5.81）和多樣性指數(shù)Shannon-Wiener（2.20）均高于莖（2.39，1.57）和葉（2.18，1.71）。陳澤斌等[57]利用Illumina測(cè)序平臺(tái)的MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)鐵皮石斛不同組織中內(nèi)生細(xì)菌的組成分布進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，內(nèi)生細(xì)菌的豐富度為葉>根>莖，經(jīng)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)根、莖、葉中的優(yōu)勢(shì)菌屬為食酸菌屬（Acidovorax）和假單胞菌屬（Pseudomonas），另外，還檢測(cè)到少許沒(méi)有被分離鑒定過(guò)的低豐度內(nèi)生細(xì)菌類群（占比低于10.00%），如瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、布赫納氏菌屬（Buchnera）等。而通過(guò)傳統(tǒng)組織分離方法對(duì)藥用石斛內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定的研究表明，優(yōu)勢(shì)菌屬為芽孢桿菌屬（Bacillus），而且從根部分離出的內(nèi)生細(xì)菌豐度最高。這進(jìn)一步顯示出了新一代測(cè)序技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，傳統(tǒng)的組織分離方法具有一定的局限性，分離出的大多數(shù)是較活躍的較少部分內(nèi)生細(xì)菌。同時(shí)，芽孢桿菌屬（Bacillus）細(xì)菌在植物體內(nèi)大多是以孢子的形式存在，但目前提取植物組織DNA多采用十二烷基硫酸鈉（Sodium Dodecyl Sulfate，SDS）十六烷基三甲基溴化銨（Cetyltrimethylammonium Bromide，CTAB）法，不能使其裂解，進(jìn)而未能獲取到該菌屬細(xì)菌的基因組DNA。由此可見(jiàn)，在未來(lái)的藥用石斛內(nèi)生菌的研究中，通過(guò)結(jié)合傳統(tǒng)的組織分離方法和微生物多樣性免培養(yǎng)分析方法，可為研究?jī)?nèi)生菌提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持，這將有助于我們識(shí)別和獲得一些新的或難以分離篩選的內(nèi)生菌株。

2.2?研究藥用石斛內(nèi)生細(xì)菌的重要性

通過(guò)傳統(tǒng)組織分離法對(duì)藥用石斛可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離篩選研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌屬（Bacillus）細(xì)菌所占比例最高，說(shuō)明該屬細(xì)菌在藥用石斛生長(zhǎng)史中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。同時(shí)，芽孢桿菌屬（Bacillus）因其能分泌多種天然代謝產(chǎn)物而成為研究的熱點(diǎn)，具有較強(qiáng)的促進(jìn)植物生長(zhǎng)、防治植物病蟲(chóng)害和增強(qiáng)植物抗逆性等作用，并能在不利的環(huán)境條件下生存很長(zhǎng)時(shí)間，具有很大的發(fā)展?jié)摿58]。童文君等[52]對(duì)不同產(chǎn)地美花石斛的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離、鑒定以及促生能力的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隸屬于芽孢桿菌屬（Bacillus）、腸桿菌屬（Enterobacter）和假單胞菌屬（Pseudomonas）的8株內(nèi)生細(xì)菌菌株兼具解無(wú)機(jī)磷、解有機(jī)磷、解鉀以及分泌生長(zhǎng)素的特性。楊紹周等[53]從鼓槌石斛中分離篩選得到具有生防功能的4株芽孢桿菌屬（Bacillus）菌株和1株鏈霉菌屬（Streptomyces）菌株、具有解磷功能的1株腸桿菌屬（Enterobacter）菌株和1株不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）菌株、具有固氮功能的1株克雷伯氏菌屬（Klebsiella）菌株。高陽(yáng)等[59]從金釵石斛中分離得到能產(chǎn)生IAA的芽孢桿菌屬（Bacillus）和類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）內(nèi)生菌株，其菌株發(fā)酵上清液對(duì)玉米種子進(jìn)行浸種處理后，可有效緩解高度干旱脅迫對(duì)其種子萌發(fā)的影響，其中有7株內(nèi)生細(xì)菌的發(fā)酵上清液可顯著提高玉米種子的萌發(fā)率。何勁等[60]從金釵石斛莖組織中分離得到一株芽孢桿菌屬（Bacillus）菌株DEB-2，結(jié)果表明，該菌株能同時(shí)對(duì)5 種辣椒病原真菌菌絲的生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)表現(xiàn)出顯著的抑制效果，具有一定的生防潛力。本課題組通過(guò)傳統(tǒng)的內(nèi)生菌分離法從6個(gè)不同種的石斛莖組織中共分離出內(nèi)生細(xì)菌165株，通過(guò)16S rRNA基因序列比對(duì)分析，分屬于20個(gè)菌屬，43個(gè)菌種。其中，短小桿菌屬（Curtobacterium，44%）和芽孢桿菌屬（Bacillus，18%）所占比例最高。對(duì)這43株菌種進(jìn)行體外發(fā)酵萃取，并進(jìn)行抑菌活性篩查，主要針對(duì)1種石斛病原細(xì)菌—果膠桿菌屬（Pectobacterium carotovorum subsp.Actinidiae）、2種石斛病原真菌—羅爾阿太菌（Athelia rolfsii）和露濕漆斑菌（Myrotheciuum roridum），其中有14株內(nèi)生細(xì)菌對(duì)至少一種指示病原菌具有抑制效果，分屬于9個(gè)菌屬，其中207號(hào)菌株—巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium，相似率100%）對(duì)3種指示病原菌均有很好的抑制活性[48]。

綜上可見(jiàn)，雖然目前對(duì)藥用石斛內(nèi)生菌的研究多集中于內(nèi)生真菌，對(duì)于內(nèi)生細(xì)菌的研究涉足較少。但是從已發(fā)表的研究結(jié)果來(lái)看，藥用石斛的內(nèi)生細(xì)菌也具有很大的發(fā)展?jié)摿?，特別是作為研究熱點(diǎn)的可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌菌株—芽孢桿菌屬（Bacillus），是獲得天然抗菌活性物質(zhì)及開(kāi)發(fā)綠色菌肥的又一重要資源;同時(shí)，通過(guò)結(jié)合免培養(yǎng)測(cè)序技術(shù)，設(shè)計(jì)特定培養(yǎng)基培養(yǎng)稀有菌屬菌株，也是一個(gè)開(kāi)發(fā)活性功能物質(zhì)的有效途徑。

3?結(jié)論與展望

藥用石斛內(nèi)生菌可通過(guò)多種途徑增強(qiáng)石斛的營(yíng)養(yǎng)及生理和抗性機(jī)能，但有關(guān)內(nèi)生菌與宿主石斛之間互作機(jī)制的研究尚不明確，限制了藥用石斛內(nèi)生菌在生產(chǎn)上的應(yīng)用。此外，因藥用石斛內(nèi)生菌種類較為繁多，體內(nèi)外所處環(huán)境復(fù)雜，目前對(duì)于藥用石斛內(nèi)生菌尚處于單一菌株的研究階段，對(duì)混合菌株協(xié)同作用機(jī)制的研究還相對(duì)較少。盡管如此，在自然條件下，藥用石斛內(nèi)生菌在宿主石斛種子萌發(fā)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供給以及促進(jìn)幼苗生長(zhǎng)中起著不可替代的作用，對(duì)宿主植物的病原菌也具有一定的抑制效果。作為藥用石斛藥用活性成分篩選的重要來(lái)源，藥用石斛內(nèi)生菌應(yīng)用前景十分廣闊，筆者建議未來(lái)藥用石斛的研究可從以下幾個(gè)方面著手：

（1）結(jié)合傳統(tǒng)的組織分離法和新一代的分子生物測(cè)序分析技術(shù)對(duì)不同產(chǎn)地、不同品種的藥用石斛內(nèi)生菌進(jìn)行全面的深入挖掘研究，獲得一些有效的分離和檢測(cè)內(nèi)生菌的方法;

（2）從分類學(xué)的角度研究藥用石斛內(nèi)生菌及宿主植物的整個(gè)微生態(tài)環(huán)境，豐富菌種資源庫(kù);

（3）通過(guò)結(jié)合微生物組學(xué)以及代謝組學(xué)技術(shù)，探究藥用石斛內(nèi)生菌與其具有藥理活性的次級(jí)代謝物之間的關(guān)系，進(jìn)而提高藥用石斛的藥理效用;

（4）篩選出能產(chǎn)生與藥用石斛相同或相似生理活性成分或其他新的活性成分的內(nèi)生菌，并進(jìn)一步結(jié)合生物發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模的生產(chǎn)，可有效地解決藥用石斛資源稀缺、藥用受阻等問(wèn)題;（5）通過(guò)分子生物技術(shù)尋找藥用石斛內(nèi)生菌中相關(guān)的功能基因，進(jìn)一步選擇并克隆其相關(guān)功能基因進(jìn)行表達(dá)，以便高效、大量地獲得藥理活性成分;此外，或可將藥用石斛內(nèi)生菌作為外源基因載體，將某些特定基因?qū)雰?nèi)生菌中，這樣既可以增強(qiáng)宿主植物的抗性或提高其產(chǎn)生某種特殊活性物質(zhì)的能力，又保持了藥用石斛自身的基因和天然性狀。

參考文獻(xiàn)

[1]曾宋君.中國(guó)藥用石斛種類介紹[J].花卉，2015（4）：19-26.

[2]Zhou Chun-Hua，et al.Simultaneous identification and determination of flavonoids in Dendrobium officinale[J].Chemistry Central Journal，2018，12（1）：40.

[3]楊鵬舉.神農(nóng)本草經(jīng)[M].北京：學(xué)苑出版社，2002：51.

[4]中國(guó)藥典委員會(huì).中國(guó)藥典第1卷[M].北京：中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)出版社，2015.

[5]Tang Han-Xiao，et al.Dendrobium officinale Kimura et Migo：a review on its ethnopharmacology，phytochemistry，pharmacology，and industrialization[J].Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine，2017（5）：1-19.

[6]Martina Kberl，et al.The microbiome of medicinal plants：diversity and importance for plant growth，quality，and health[J].Frontiers in Microbiology，2013，4：400.

[7]Stierle A，Strobel GA，Stierle DB.Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae，an endophytic fungus of Pacific yew[J].Science，1993，260（5105）：214-216.

[8]Huang Wu-Yang，Cai Yi-Zhong，Xing Jie，et al.A potential antioxidant resource：endophytic fungi from medicinal plants[J].Economic Botany，2007，61（1）：14-30.

[9]黃暉，邵士成，高江云.不同內(nèi)生真菌對(duì)齒瓣石斛幼苗生長(zhǎng)的效應(yīng)[J].中國(guó)中藥雜志，2016，41（11）：2019-2024.

[10]陳曉梅，郭順星.環(huán)草石斛內(nèi)生真菌分離、鑒定及其抗菌活性研究[C].全國(guó)藥用真菌學(xué)術(shù)研討會(huì)，2008：29-34.

[11]柴曉蕾，等.華石斛內(nèi)生真菌組織分布特點(diǎn)及其抑菌活性[J].熱帶作物學(xué)報(bào)，2018，39（1）：137-144.

[12]王亞妮，王麗琨，苗宗保，等.流蘇石斛根部?jī)?nèi)生真菌多樣性研究[J].生態(tài)科學(xué)，2014（4）：672-679.

[13]李瑛婕，等.美花石斛優(yōu)勢(shì)內(nèi)生菌根真菌生物學(xué)特性研究[J].中國(guó)園藝文摘，2010，26（8）：17-19.

[14]羅在柒，乙引，姚柳焓.金釵石斛與環(huán)草石斛內(nèi)生真菌對(duì)其宿主植物生長(zhǎng)效應(yīng)的影響[J].貴州林業(yè)科技，2008，36（1）：28-32.

[15]李昊.鐵皮石斛內(nèi)生真菌的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（8）：3377-3378.

[16]張煒玲，王新生，戴亞峰，等.霍山石斛最新研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（36）：20661-20663.

[17]Shah S，Shrestha R，Maharjan S，et al.Isolation and characterization of plant growth-promoting endophytic fungi from the roots of Dendrobium moniliforme [J].Plants （Basel），2019，8（1）：5.

[18]Chen Juan，Wang Hui，Guo Shun-Xing.Isolation and identification of endophytic and mycorrhizal fungi from seeds and roots of Dendrobium （Orchidaceae）[J].Mycorrhiza，2012，22（4）：297-307.

[19]張延威，韓燕峰.石斛內(nèi)生真菌多樣性的初步研究[J].貴州師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，20（6）：9-12.

[20]徐焰平.鐵皮石斛內(nèi)生真菌研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)雜志，2015（5）：108-112.

[21]Yuan Zhi-Lin，Chen Yi-Cun，Yang Yun.Diverse non-mycorrhizal fungal endophytes inhabiting an epiphytic，medicinal orchid （Dendrobium nobile）：estimation and characterization [J].World Journal of Microbiology & Biotechnology，2009，25（2）：295-303.

[22]洪群艷，等.幾種云南野生石斛內(nèi)生真菌的鑒定及分布[J].生物技術(shù)進(jìn)展，2012，2（3）：190-194.

[23]毛益婷，代曉宇，馬榮.不同生境下野生鐵皮石斛內(nèi)生真菌多樣性的初步研究[J].新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，34（3）：234-238.

[24]陳玉棟，李文錦，雷玲，等.鐵皮石斛內(nèi)生真菌的分離與鑒定[J].信陽(yáng)師范學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2009，22（2）：236-238.

[25]胡克興，侯曉強(qiáng)，郭順星.鐵皮石斛內(nèi)生真菌分布[J].微生物學(xué)通報(bào)，2010，37（1）：37-42.

[26]董飛.野生鐵皮石斛內(nèi)生菌的分離及促生作用研究[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2010（9）：96-97.

[27]孟娉，邵士成，彭貴湖.不同內(nèi)生真菌對(duì)鐵皮石斛幼苗生長(zhǎng)的效應(yīng)[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017（6）：114-118.

[28]陳娟，張麗春，邢詠梅，等.蘭科石斛屬植物菌根共生研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2013，48（19）：1644-1648.

[29]字肖萌，高江云.不同真菌對(duì)2種藥用石斛種子共生萌發(fā)的效應(yīng)[J].中國(guó)中藥雜志，2014，39（17）：3238-3244.

[30]Chen Xiao-Mei，Dong Hai-Ling，Hu Ke-Xing，et al.Diversity and antimicrobial and plant-growth-promoting activities of endophytic fungi in Dendrobium loddigesii[J].Journal of Plant Growth Regulation，2010，29（3）：328-337.

[31]吳智彪，等.華石斛內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子對(duì)其組培苗生長(zhǎng)的影響[J].熱帶作物學(xué)報(bào)，2006，27（1）：77-79.

[32]馬昭.基于高通量測(cè)序技術(shù)的不同產(chǎn)地鐵皮石斛內(nèi)生菌比較研究[D].上海：上海中醫(yī)藥大學(xué)，2015.

[33]Xu XB，Ma XY，Lei HH，et al.Proteomic analysis reveals the mechanisms of Mycena dendrobii promoting transplantation survival and growth of tissue culture seedlings of Dendrobium officinale[J].Journal of Applied Microbiology，2015，118（6）：1444-1455.

[34]趙英梅.石斛內(nèi)生真菌互作分子機(jī)理初步研究[D].杭州：杭州師范大學(xué)，2012.

[35]Stierle A，Strobel GA，Stierle DB.Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae，an endophytic fungus of Pacific yew[J].Science，1993，260（5105）：214-216.

[36]陳曉梅，郭順星.4種內(nèi)生真菌對(duì)金釵石斛無(wú)菌苗生長(zhǎng)及其多糖和總生物堿含量的影響[J].中國(guó)中藥雜志，2005，30（4）：253-257.

[37]羅在柒，等.內(nèi)生真菌分泌物對(duì)金釵石斛酶活性的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（31）：15236-15237.

[38]張麗春，郭順星.5種石斛內(nèi)生真菌的分離及其抗菌活性研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2009，44（20）：1540-1542.

[39]周琢艷，劉玉寒，劉文洪，等.鐵皮石斛內(nèi)生真菌的分離及其體外抑菌和抗腫瘤活性初步研究[J].中草藥，2017，48（3）：533-538.

[40]岳婧怡，郁陽(yáng)，湯強(qiáng)，等.霍山石斛內(nèi)生真菌抗病原真菌研究[J].長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，15（22）：43-45.

[41]劉小莉，胡彥新，彭歡歡，等.內(nèi)生真菌綠色生態(tài)法合成納米銀的研究[J].現(xiàn)代食品科技，2017（1）：119-124.

[42]相子春.真菌發(fā)酵產(chǎn)物提取物抗HIV-1活性研究[D].北京：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)，2005.

[43]Wu Ling-Shang，et al.Cytotoxic and antifungal constituents isolated from the metabolites of endophytic fungus DO14 from Dendrobium officinale[J].Molecules，2016，21（1）：14.

[44]劉維，等.一株鐵皮石斛內(nèi)生真菌H1B1產(chǎn)紅色素穩(wěn)定性的研究[J].中國(guó)食品添加劑，2016（1）：71-75.

[45]龔鶯，何伯偉，王淑珍，等.鐵皮石斛內(nèi)生菌研究進(jìn)展[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58（8）：1372-1375.

[46]吳慶珊，等.金釵石斛內(nèi)生細(xì)菌的組成及多樣性分析[J].植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2018，27（1）：79-90.

[47]Pei Cong，Mi Chun-Yi，Sun Li-Hua，et al.Diversity of endophytic bacteria of Dendrobium officinale based on culture-dependent and culture-independent methods[J].Biotechnology & Biotechnological Equipment，2016，31（1）：1-8.

[48]Wang Shan-Shan，Liu Jia-Meng，Sun Jing，et al.Diversity of culture-independent bacteria and antimicrobial activity of culturable endophytic bacteria isolated from different Dendrobium stems [J].Scientific Reports，2019，9（1）：10389.

[49]俞婕，周小風(fēng)，胡秀芳.鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定與酶活性分析[J].浙江理工大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2013，30（6）：896-900.

[50]章華偉，鐘超群.鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌的分離和初步鑒定[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（8）：1811-1813.

[51]王明月，陶茜，李克艷，等.鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析[J].西部林業(yè)科學(xué)，2014，43（5）：106-111.

[52]童文君，等.不同產(chǎn)地美花石斛內(nèi)生細(xì)菌分離及促生潛力比較[J].植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2014，23（1）：16-23.

[53]楊紹周，等.鼓槌石斛內(nèi)生細(xì)菌分離、鑒定及功能分析[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2014，30（25）：171-176.

[54]李驁，宋希強(qiáng).海南島華石斛根部可培養(yǎng)的共生細(xì)菌的多樣性[J].熱帶生物學(xué)報(bào)，2015，6（3）：279-284.

[55]Wu Li-Qin，et al.Isolation and characterization of antagonistic endophytes from Dendrobium candidum Wall ex Lindl.and the biofertilizing potential of a novel Pseudomonas saponiphila strain[J].Applied Soil Ecology，2016（105）：101-108.

[56]安忠琦，詹偉，吳慶珊，等.金釵石斛根際可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性及抑菌活性研究[J].云南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2018，195（3）：188-204.

[57]陳澤斌，等.鐵皮石斛不同部位內(nèi)生細(xì)菌群落高通量分析[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，46（11）：98-102.

[58]Ramalingam R，et al.Bacillus：a biological tool for crop improvement through bio-molecular changes in adverse environments[J].Frontiers in Physiology，2017，8（8）：667.

[59]高陽(yáng)，等.金釵石斛IAA內(nèi)生細(xì)菌篩選及對(duì)干旱脅迫下玉米種子萌發(fā)的影響[J].種子，2017，36（4）：36-41.

[60]何勁，等.石斛內(nèi)生細(xì)菌DEB-2對(duì)5種辣椒病原真菌的抑制作用[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2014，41（2）：157-162.