hERβ重組質(zhì)粒pEGFP-C1-hERβ對(duì)PC-3M細(xì)胞凋亡的影響

于鎧銘

【摘? ? 要】前列腺癌（PCa）是男性常見的惡性腫瘤，在美國(guó)男性癌癥病死率為第2位，僅次于肺癌。近十年來PCa發(fā)病率在許多國(guó)家中（包括中國(guó)在內(nèi)的）有逐年上升的趨勢(shì)。目前我國(guó)PCa的發(fā)病率在男性泌尿系統(tǒng)腫瘤的位居第3位。目前普遍認(rèn)為雌激素與雌激素受體（ER），特別是ERβ在PCa的發(fā)生、發(fā)展、惡變和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)：雌激素與抗雌激素對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞株均有抑制作用;抗雌激素對(duì)前列腺癌DU145細(xì)胞株有抑制作用。本實(shí)驗(yàn)通過重塑ERβ在前列腺癌PC-3M細(xì)胞株中的表達(dá)，研究和分析ERβ對(duì)前列腺癌細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑的影響。

【關(guān)鍵詞】前列腺癌? 雌激素? 抗雌激素

中圖分類號(hào)：G4? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.3969/j.issn.1672-0407.2020.15.200

一、材料和方法

（一）材料

人前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3M（ATCC）。真核表達(dá)載體pcDNA3.1、脂質(zhì)體Lipofetion2000（Invitrogen），pEGFP-C1質(zhì)粒、限制性內(nèi)切酶BamH I、HindⅢ、TA克隆載體（pMD18-T Vector）、T4 DNA連接酶及質(zhì)粒提取和純化試劑盒（TaKaRa），Trizol（GIBCO），胎牛血清（Hyclone），高保真Taq DNA聚合酶（Sangon）等。ERβ兔抗人多克隆抗體、β-actin羊抗人多克隆抗體、堿性磷酸酶標(biāo)記與辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔多克隆抗體（SANTA CRUZ）;Caspase-3、Caspase-9兔抗人多克隆抗體（北京中山金橋生物技術(shù)有限公司）。本實(shí)驗(yàn)所用引物均為上海生工公司合成。

（二）方法

1. pEGFP-C1-hERβ重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定。在前期工作中，應(yīng)用基因重組技術(shù)，構(gòu)建pEGFP-C1-hERβ重組質(zhì)粒;采用質(zhì)粒提取試劑盒，按產(chǎn)品說明提取質(zhì)粒，應(yīng)用HindⅢ和Xhol進(jìn)行雙酶切鑒定及雙向自動(dòng)測(cè)序分析儀測(cè)序分析鑒定構(gòu)建的質(zhì)粒。

2.細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染。人激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3M細(xì)胞（1×106）接種于100 mL培養(yǎng)瓶中，于IMDM培養(yǎng)基（含10%小牛血清）， 37℃，5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。當(dāng)貼壁細(xì)胞達(dá)到70%-80%融合時(shí)，取重組質(zhì)粒6μg，以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染細(xì)胞，培養(yǎng)24 h。同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組（只加脂質(zhì)體，不加質(zhì)粒）和空質(zhì)粒對(duì)照組（轉(zhuǎn)染pEGFP-C1）。然后換完全培養(yǎng)基（含10%小牛血清）繼續(xù)培養(yǎng)48 h，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)，收集細(xì)胞備用。

3. 免疫細(xì)胞化學(xué)染色分析。轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后離心，收集細(xì)胞（同上），調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106，取10μL滴加到用多聚賴氨酸處理過的玻片上，室溫放置30 min;以4%多聚甲醛固定，Triton-X 100 洗10 min;3% H2O2 孵育25 min（以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶）;室溫反應(yīng)1 h;滴加生物素化羊抗兔IgG于蓋玻片上， 37℃ 孵育30 min;滴加辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的親和素，37℃ 孵育30 min;上述每步抗體均為50μL/片，反應(yīng)后均用PBS洗滌3次。最后于光學(xué)顯微鏡下觀察并照相。結(jié)果判定：細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞。

4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡峰。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的PC-3M細(xì)胞分為兩組，實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-hERβ（2μg/mL），對(duì)照組轉(zhuǎn)染pEGFP-C1，培養(yǎng)72 h，分別制成單細(xì)胞懸液。用流式細(xì)胞儀做單參數(shù)分析，每份樣品檢測(cè)1×104細(xì)胞。

5.吖啶橙染色凋亡細(xì)胞。將轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-hERβ和pEGFP-C1質(zhì)粒的PC-3M細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，離心，洗滌，棄上清，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL。取95μL加入0.1%的吖啶橙（AO），熒光顯微鏡觀察細(xì)胞顏色及形態(tài)。

6.TUNEL染色分析。取10μL胰酶消化處理后的PC-3M細(xì)胞（濃度為1×106/mL），滴加到預(yù)先用多聚賴氨酸處理的玻片上，室溫放置30 min。4%多聚甲醛固定30 min。用新鮮配制的3%H2O2，室溫處理10 min。在標(biāo)本片上加TBS（0.01M） 1∶200新鮮稀釋的Proteinase K，在37℃消化1-15 min。加標(biāo)記緩沖液20μL/片（以保持切片濕潤(rùn)）。每張切片取末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）和地高辛標(biāo)記的dUTP（DIG-dUTP）各1μL，加入18μL標(biāo)記緩沖液中并混勻。去除切片上多余液體，加標(biāo)記液20μL/片。把樣品置于濕盒中，37℃標(biāo)記2 h。加封閉液50μL/片，室溫30 min后去除封閉液。用抗體稀釋液1∶100稀釋生物素化抗地高辛抗體，混勻后50μL/片加至標(biāo)本片上。在濕盒中，37℃反應(yīng)30 min。同樣的操作處理鏈霉親和素-過氧化物（SABC）。每步結(jié)束后均用0.01M TBS洗滌。采用DAB顯色：染色步驟及結(jié)果判定同2.3中DAB顯色。

7. RT-PCR半定量分析。應(yīng)用Trizol按說明提取100 mL培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以β-actin作為內(nèi)參照，PCR法檢測(cè)Bcl-XL、AKt、caspase-3、caspase-9等基因的表達(dá)情況。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，30個(gè)循環(huán)（94℃ 30s→55℃ 30 s→72℃ 1 min），最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，利用GIS數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)拍照并測(cè)定電泳條帶灰度值，以目的基因與內(nèi)參β-actin條帶灰度比值表示其含量。

8. Western blot 檢測(cè)。轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞（分組同前），用蛋白刮子刮下，PBS洗滌，利用細(xì)胞蛋白裂解提取總蛋白，測(cè)定蛋白濃度（Bio-Rad），每組取50 μg蛋白分別經(jīng)10% SDS-PAGE電泳分離，用Western blot 檢測(cè)caspase-3及caspase-9蛋白表達(dá)情況。各組分別以對(duì)照組的目的蛋白與β-actin光密度的比值作為內(nèi)參進(jìn)行比較。

9. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析，P<0.05。

二、結(jié)果

（一） hERβ在PC-3M細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)

熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)，同時(shí)應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞中hERβ的表達(dá)。結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-hERβ的PC-3M細(xì)胞，GFP表達(dá)陽(yáng)性;免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染ERβ的細(xì)胞，大部分呈陽(yáng)性染色，尤其是細(xì)胞核棕黃色染色明顯。

（二） hERβ促進(jìn)PC-3M細(xì)胞凋亡

1.流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-hERβ的PC-3M細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比，在G1前出現(xiàn)了亞二倍峰，即為凋亡峰。凋亡細(xì)胞數(shù)目占總細(xì)胞數(shù)的13.7%，凋亡細(xì)胞明顯增加。

2. 吖啶橙實(shí)驗(yàn)。吖啶橙實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞出現(xiàn)了被染為桔黃色的凋亡細(xì)胞;而對(duì)照組細(xì)胞則偶見被染為桔黃色的凋亡細(xì)胞。說明轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-hERβ質(zhì)?？纱龠M(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

3.TUNEL檢測(cè)。TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-hERβ的細(xì)胞，出現(xiàn)陽(yáng)性染色，胞核呈深棕黃色。細(xì)胞大小不一，結(jié)構(gòu)不完整，可見胞質(zhì)凝縮，核斷裂相。

（三） RT-PCR檢測(cè)

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞未見抗凋亡基因Bcl-XL表達(dá);而AKt的表達(dá)明顯減少;凋亡基因caspase-9的表達(dá)則增加，而caspase-3的mRNA表達(dá)減少。

（四）Western blot 檢測(cè)

Western blot結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-hERβ的PC-3M細(xì)胞，可見17 KD的caspase-3片斷，和37 KD的caspase-9片段。提示轉(zhuǎn)染細(xì)胞中caspase-3和caspase-9的活化。

三、討論

Bardin等研究證明，轉(zhuǎn)染ERβ到卵巢癌細(xì)胞后，可引起細(xì)胞凋亡。Cheng等把ERβ基因轉(zhuǎn)染到前列腺癌細(xì)胞株DU145中，細(xì)胞增殖抑制，誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。因此推測(cè)ERβ可能是一種腫瘤抑制基因，研究ERβ對(duì)前列腺癌細(xì)胞凋亡途徑的影響，對(duì)前列腺癌患者的治療具有重要的研究意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)顯示ERβ轉(zhuǎn)染PC-3M細(xì)胞后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞在G1期前出現(xiàn)凋亡峰;鏡下可見細(xì)胞核內(nèi)染色體邊集，呈新月形或馬蹄形分布。上述實(shí)驗(yàn)指標(biāo)證明，ERβ轉(zhuǎn)染PC-3M細(xì)胞后，誘發(fā)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。

細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制的核心是一類蛋白水解酶，統(tǒng)稱為天冬氨酸蛋白酶（cysteine-requiring aspartate protease，caspase）家族。caspase-3是凋亡過程中激活的關(guān)鍵激酶，也是凋亡的主要效應(yīng)因子。caspase-9與caspase-3一樣，也可以把PARP剪切成85KD的小片段。western blot結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染ERβ的細(xì)胞，caspase-3及caspase-9表達(dá)明顯增加（P<0.05），實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Bcl-XL是B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2蛋白（B-celllymphoma/leukemia-2protein，Bcl-2）Bcl-2家族中的重要成員。Bcl-X基因可翻譯Bcl-XL和Bcl-Xs兩種蛋白，Bcl-XL比Bcl-Xs多出一個(gè)BH4結(jié)構(gòu)域，可抑制細(xì)胞凋亡，而Bcl-Xs則促進(jìn)細(xì)胞凋亡。研究表明Bcl-XL可通過多條途徑發(fā)揮抗凋亡作用：通過穩(wěn)定線粒體膜電位、阻止線粒體釋放凋亡誘導(dǎo)因子，阻抑caspase的級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)等。激活后的Akt通過對(duì)含有絲氨酸&蘇氨酸殘基的底物磷酸化而發(fā)揮廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。PCR結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染ERβ的PC-3M細(xì)胞，Bcl-XL和AKt的表達(dá)明顯降低。

綜上所述， ERβ引起前列腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡的可能機(jī)制是： ERβ的增加抑制AKt和Bcl-XL基因的活性，使之喪失抑制Apaf-1的功能;促進(jìn)細(xì)胞色素C（Apaf-2）從線粒體內(nèi)釋放并與Apaf-1結(jié)合;進(jìn)而促進(jìn)caspase-9（Apaf-3）與之結(jié)合并激活，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生改變及核小體間的DNA降解等一系列變化。