正交設(shè)計(jì)法優(yōu)選美白復(fù)方中藥提取工藝及體外抗氧化活性研究

錢春喜 齊祥秋 孫玉娣

【摘 要】 目的：采用正交設(shè)計(jì)法優(yōu)選美白復(fù)方中藥的提取工藝并進(jìn)行體外抗氧化活性考察。方法：篩選具有美白活性的5種中藥甘草、桑白皮、懷山藥、白芍和蘆薈，以乙醇為溶劑，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化提取工藝，以酪氨酸酶抑制率和DPPH自由基清除率為綜合指標(biāo)評(píng)價(jià)復(fù)方中藥提取物的美白功效。結(jié)果：該中藥復(fù)方具有一定的酪氨酸酶抑制活性和DPPH自由基清除作用，正交設(shè)計(jì)確定的最優(yōu)提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)80%，料液比1∶ 7，提取時(shí)間2 h、提取次數(shù)1次，采取此提取工藝。結(jié)論：該中藥復(fù)方具有一定的美白功效，可為中藥資源在美白化妝品中的開發(fā)利用提供參考。

【關(guān)鍵詞】 中藥美白復(fù)方;正交設(shè)計(jì);酪氨酸酶;DPPH;抗氧化

【中圖分類號(hào)】R284.2 ? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A ? ?【文章編號(hào)】1007-8517（2020）7-0023-04

Abstract：Objective To optimize the extraction process of whitening traditional Chinese medicine compound by orthogonal design.Methods Five kinds of traditional Chinese medicine were selected to evaluate the whitening effect and optimized by orthogonal design.The inhibition rate of tyrosinase and the scavenging rate of DPPH free radical were set as criteria to evaluate the whitening effect and optimize the best ethanol extraction process in orthogonal design method on the basis of single-factor experiments.Results The traditional Chinese medicine compound alcohol extract had certain inhibition rate of tyrosinase and scavenging rate of DPPH free radical.The optimum extraction process was using seven fold 80% of ethanol for 1 time of reflux extraction with 1.5 h， and the whitening effect of the traditional Chinese medicine compound was the best.Conclusion The traditional Chinese medicine compound has certain whitening effect， which provides a reference for the development of traditional Chinese medicine resources in whitening makeup products.

Keywords：Whitening Traditional Chinese Medicine; Orthogonal Design; Tyrosinase; DPPH; Antioxidant

中國女性對(duì)美白的追求歷史悠久，美白類護(hù)膚品已成為功效性護(hù)膚品的重要組成部分[1]。傳統(tǒng)的人工合成小分子化合物如曲酸、煙酰胺、對(duì)苯二酚等雖具抗氧化和美白功效，但使用過程中常出現(xiàn)過敏、不耐受、刺激等諸多問題[2]，而從天然植物資源中提取美白活性成分更顯綠色安全，已成為護(hù)膚品研發(fā)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。美白機(jī)制的核心是抑制皮膚黑色素的生成，其中既催化羥化反應(yīng)又參與氧化反應(yīng)的酪氨酸酶，是黑色素形成過程中的限速酶[3]。因此，可通過抑制酪氨酸酶活性和清除自由基抗氧化的方式來減少黑色素形成，同時(shí)根據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)理論，選擇具有行氣活血的中藥，通過紓解郁結(jié)、氣血互補(bǔ)、促進(jìn)代謝，亦可減少黑色素生成獲得美白功效[4]。現(xiàn)代科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，甘草、桑白皮、懷山藥、白芍和蘆薈具有良好的酪氨酸酶抑制活性和自由基清除作用[5-8]，本研究將上述5種中藥組成復(fù)方，采用正交設(shè)計(jì)法，以酪氨酸酶抑制率和DPPH自由基清除率作為美白活性評(píng)價(jià)指標(biāo)，篩選最佳提取工藝，為新型中藥美白妝品的開發(fā)提供參考。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 UV752紫外分光光度計(jì)（上海精科分析儀器廠）;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）;HWS24型水浴鍋（西安禾普生物科技有限公司）;電子天平（上海精科分析儀器廠）。

1.2 試劑 0.1 mol/L鹽酸（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）;無水乙醇（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）;磷酸氫二鈉（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）;磷酸二氫鈉（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）;DPPH（1，1-Dipheyl-2-picrylhydrazyl radicle，1，1-二苯基-2-苦基苯肼自由基）（日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社，批號(hào)：ALE1299）;1380 U/mg酪氨酸酶（25 KU）（美國Worthington試劑公司，批號(hào)：E608BD0304）;L-多巴胺（上海伊卡生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：E118BA0025）;甘草（批號(hào)：020116296）、桑白皮（批號(hào)：020116126）、懷山藥（批號(hào)：020116324和白芍（批號(hào)：020116193）均為安徽尚德中藥飲片有限公司生產(chǎn)，蘆薈（批號(hào)：020114443，廠家：安徽孟氏中藥飲片有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 美白復(fù)方中藥的提取 稱取甘草5 g，桑白皮5 g，白芍5 g，山藥5 g，蘆薈提取物1 g，備用。依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)原理，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取次數(shù)和提取時(shí)間四個(gè)因素，在此基礎(chǔ)上開展正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)L9（34）。采用加熱回流提取，提取液蒸發(fā)濃縮至15 mL，用無水乙醇稀釋濃縮液制得供試藥液21 mL（約相當(dāng)于原生藥1 g/mL），備用。

2.2 美白活性評(píng)價(jià)

2.2.1 酪氨酸酶抑制率的測(cè)定

2.2.1.1 溶液的配制 ①磷酸鹽緩沖液（PBS）的配制 準(zhǔn)確稱取磷酸氫二鈉7.16 g和磷酸二氫鈉3.12 g，加去離子水充分溶解，分別轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中定容配制成0.2 mol/L的溶液，以51∶ 49的比例混合均勻，pH調(diào)至6.8，即得。

②酪氨酸酶溶液的配制 精密稱取一定量的酪氨酸酶（1380 U/mg），用PBS溶解配成200 U/mg的酶液，-20 ℃保存，用前于4 ℃解凍。

③多巴溶液的配制 精密稱取L-多巴胺0.15 g，加0.1 moL/L的鹽酸溶液預(yù)溶，待完全溶解，加PBS 100 mL稀釋配制1.5 g/L多巴溶液，4 ℃避光保存。

④樣品溶液的配制 用PBS將供試藥液稀釋，使反應(yīng)體系中藥液的終濃度為1 mg/mL。

2.2.1.2 測(cè)定方法 參考文獻(xiàn)[9]按照表1，在各試管中分別加入PBS、樣品溶液和酪氨酸酶溶液，混合均勻，于恒溫水?。?7℃）反應(yīng)10 min，分別迅速加入多巴溶液1mL，充分混勻，水浴反應(yīng)5 min，取出后立即于475 nm處測(cè)定各反應(yīng)液的吸光度AC1、AC2、AT1、AT2。平行試驗(yàn)3次，按公式（1）計(jì)算供試藥液的酪氨酸酶抑制率。

酪氨酸酶抑制率=（1-（AT1-AT2）/（AC1-AC2））×100%（1）

2.2.2 DPPH自由基清除率的測(cè)定

2.2.2.1 溶液的配制 ①DPPH溶液的配制 精密稱取DPPH 0.0197 g，加無水乙醇定容至50 mL作為儲(chǔ)備液，4 ℃避光保存。精密移取儲(chǔ)備液10 mL，無水乙醇稀釋至100 mL，得100 μmol/L的DPPH溶液，4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

②樣品溶液的配制 精密量取供試藥液0.5 mL，無水乙醇稀釋至50 mL，得樣品溶液（相當(dāng)于原生藥濃度10 mg/mL）。

2.2.2.2 測(cè)定方法 參考文獻(xiàn)[10]按照表2，在各試管中加入對(duì)應(yīng)溶液，混合均勻，避光反應(yīng)30 min，于517 nm處分別測(cè)定吸光度A0、A1、A2。平行試驗(yàn)3次，按公式（2）計(jì)算供試藥液DPPH自由基清除率。

DPPH自由基清除率=[1-（A1-A2）/A0]×100%（2）

2.3 單因素試驗(yàn)考察美白活性中藥的提取工藝 選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間和提取次數(shù)4個(gè)因素，各因素設(shè)置 4個(gè)不同水平，研究各因素最佳范圍，優(yōu)化提取工藝。根據(jù)文獻(xiàn)[11]，綜合酪氨酸酶抑制率和DPPH自由基清除率，設(shè)置權(quán)重為7∶ 3定義美白度，作為評(píng)價(jià)優(yōu)化美白中藥復(fù)方提取工藝的指標(biāo)。美白度綜合評(píng)分按公式（3）計(jì)算。

美白度綜合評(píng)分=酪氨酸酶抑制率× 0.7+DPPH自由基清除率×0.3（3）

2.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取物美白功效的影響 設(shè)置乙醇體積分?jǐn)?shù)為40 %、60 %、80 %和95 % ，分別回流提取1次，每次1 h，料液比1∶ 7，測(cè)定酪氨酸酶抑制率和DPPH自由基清除率，美白度綜合評(píng)分分別為56.69%、57.59%、58.02%和69.89%，表明95%乙醇提取美白活性最佳。

2.3.2 料液比對(duì)提取物美白功效的影響 設(shè)置料液比為1∶ 6、1∶ 7、1∶ 8 和1∶ 10，用95%乙醇分別回流提取1次，每次1 h，測(cè)定酪氨酸酶抑制率和DPPH自由基清除率，美白度綜合評(píng)分分別為66.04%、65.57%、48.75%和64.18%，表明料液比1∶ 6提取美白活性最佳。

2.3.3 提取次數(shù)對(duì)提取物美白功效的影響 設(shè)置提取次數(shù)為1、2、3和4，用95%乙醇分別回流提取1 h，料液比1∶ 6，測(cè)定酪氨酸酶抑制率和DPPH自由基清除率，美白度綜合評(píng)分分別為 67.95%、54.66%、48.9%和48.24%，表明提取1次美白活性最佳。

2.3.4 提取時(shí)間對(duì)提取物美白功效的影響 設(shè)置提取時(shí)間為1、1.5、2和3 h ，用95%乙醇分別回流提取1 次，料液比1∶ 6，測(cè)定酪氨酸酶抑制率和DPPH自由基清除率，美白度綜合評(píng)分分別為54.99 %、43.51 %、59.95 %和57.03 %，表明提取2 h 美白活性最佳。

2.4 正交試驗(yàn) 以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，對(duì)乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間及提取次數(shù)進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)。分別按下表3進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果及極差分析見表4，方差分析見表5。

由表4的極差結(jié)果可知，各因素對(duì)提取物美白活性影響順序?yàn)锳（乙醇體積分?jǐn)?shù)）>B（料液比）>C（提取時(shí)間）>D（提取次數(shù)）。依據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，美白組合物最佳提取工藝為 A2B2C2D1，即乙醇體積分?jǐn)?shù)為 80%，料液比1∶ 7，提取2 h，提取 1次。按上述提取工藝進(jìn)行3批藥材的驗(yàn)證試驗(yàn)，提取物美白度綜合評(píng)分分別為84.34%、83.88%、84.76%，RSD為0.52%，證明本提取工藝穩(wěn)定可靠，且所得提取物美白活性較高。

3 討論

本研究篩選出5種具有優(yōu)良美白活性的中藥，即甘草中有效成分甘草黃酮具有抑制酪氨酸酶的活性、抑制多巴色素互變異構(gòu)酶的活性及阻止吲哚-5、6-醌的聚合，可有效抑制黑色素生成;桑白皮提取物具有顯著的清除超氧陰離子自由基和OH自由基的功效，減少黑色素形成的內(nèi)在因素，懷山藥為酪氨酸酶抑制劑，與甘草協(xié)同抑制酪氨酸酶活性，增強(qiáng)美白功效;蘆薈可吸收紫外線，是一種優(yōu)良的天然防曬劑，減弱黑色素形成的外在條件;白芍具有促進(jìn)皮膚血液循環(huán)和活血養(yǎng)顏的功效[5-8];故將上述中藥配伍使用，作用于黑色素形成的不同環(huán)節(jié)，協(xié)同增效，以實(shí)現(xiàn)全方位美白的護(hù)膚理念。

本研究以酪氨酸酶抑制率和DPPH 自由基清除率作為指標(biāo)評(píng)價(jià)復(fù)方中藥的美白活性。因美白提取物可抑制酪氨酸酶活性導(dǎo)致其催化反應(yīng)的有色產(chǎn)物多巴醌生成減少，于475 nm 處測(cè)量吸光度間接反映美白提取物對(duì)酪氨酸酶的抑制活性[12]。當(dāng)提取物中抗氧化成分加至DPPH 自由基溶液，其孤對(duì)電子被配對(duì)，深紫色的DPPH自由基被還原成黃色DPPH-H非自由基形式，于517 nm 處測(cè)定吸光度間接反映提取物抗氧化能力[13]。此法測(cè)定時(shí)間短、操作簡便、適于對(duì)美白活性成分的大范圍初篩。

4 結(jié)論

合理復(fù)配篩選出的5種中草藥，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用正交設(shè)計(jì)，以酪氨酸酶抑制率和DPPH自由基清除率為綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化美白復(fù)方中藥醇提工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù) 80 %，料液比1∶ 7 ，提取2 h，提取 1次，以此工藝制得提取物美白度平均84.33%。本研究將抑制黑色素形成和清除自由基抗氧化等途徑有機(jī)結(jié)合，充分貫徹中藥多成分、多靶點(diǎn)、多機(jī)制的協(xié)同作用理念指導(dǎo)開發(fā)中藥美白妝品，為中藥資源在化妝品領(lǐng)域的研發(fā)提供參考。 參考文獻(xiàn)

[1]韓儒雅.中國化妝品市場(chǎng)現(xiàn)狀與趨勢(shì)[J].日用化學(xué)品科學(xué)，2012，33（6）：8-11.

[2]鄢又玉，趙春芳，李三杰，等.美白護(hù)膚品作用機(jī)理及配方研發(fā)設(shè)計(jì) [J].日用化學(xué)工業(yè)，2009，39 （6）：423-427.

[3]葉希韻，朱萍亞.黑色素的合成與美白產(chǎn)品的研究進(jìn)展 [J].華東師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2016 ，3（6）：1-8.

[4]董銀卯.本草藥妝品 [M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010.

[5]FU B，LI H，WANG X，et al.Isolation and Identification of Flavonoids in Licorice and a Study of Their Inhibitory Effects on Tyrosinase[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2005，53 （19）：7408-7414.

[6]張晶，王春麗.桑白皮水提物美白機(jī)制研究 [J].日用化學(xué)工業(yè)，2010，40 （6）：444-447.

[7]黃立森，龐海月，吳黌坦，等.4種中草藥乙醇提取物體外抗氧化及美白活性研究 [J].日用化學(xué)工業(yè)，2016，46 （6）：349-352.

[8]劉薇.天然美白成分在美白化妝品中的應(yīng)用研究 [J].廣東化工，2016，13 （43）：47-53.

[9]李雪梅，甘雨，尤獻(xiàn)民，等.均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化月安煎處方最佳配伍研究 [J].西北藥學(xué)雜志，2012，27 （3）：197-199.

[10]曾宇，江濱，馬世平，等.DPPH自由基清除法篩選當(dāng)歸芍藥散抗氧化活性有效部位 [J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，29 （2）：138-141.

[11]尤卓瑩.“四物湯”中藥美白化妝品的開發(fā)及其美白作用機(jī)制研究[D].廣州：廣東藥學(xué)院，2015.

[12]王一帆，賴家珍，龍曉英，等.中藥美白機(jī)制及功效評(píng)價(jià)進(jìn)展 [J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，30 （4）：525-529.

[13]韋獻(xiàn)雅，殷麗琴，鐘成，等.DPPH法評(píng)價(jià)抗氧化活性研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2014，35 （9）：317-322.

（收稿日期：2020-01-09 編輯：程鵬飛）