HPLC測定鹽酸苯達(dá)莫司汀純度和降解破壞

杜 超，邵 斐，唐 云，李 偉*

(1.宜春學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西 宜春 336000；2.深圳萬樂藥業(yè)有限公司，廣東 深圳 518000)

鹽酸苯達(dá)莫司汀，是目前醫(yī)療領(lǐng)域?qū)鼓[瘤病癥的主要藥物之一。當(dāng)前，其主要用于治療非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌以及骨髓瘤等多種疾病，并且使復(fù)發(fā)與死亡出現(xiàn)的機(jī)率顯著降低[1-2]。鹽酸苯達(dá)莫司汀最早是60年代在東德被合成出來，本意是想合成一種比其他烷化劑毒性更小，但性能相當(dāng)?shù)牡牡婊衔?，?dāng)把氮芥群移到苯并咪唑環(huán)的5位上后，就形成了一種新的氮芥類化合物[3]。后來，因?yàn)槠渲饾u用于抗腫瘤領(lǐng)域，且療效明顯，最終被名為鹽酸苯達(dá)莫司汀。同時(shí)，因?yàn)樗?dú)特的結(jié)構(gòu)特征，使其同時(shí)具有烷基化和抗代謝作用。其構(gòu)成部分主要是一個(gè)氮芥群，一個(gè)苯并咪唑環(huán)和一個(gè)丁酸側(cè)鏈[4-5]，結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 鹽酸苯達(dá)莫司汀結(jié)構(gòu)式

鹽酸苯達(dá)莫司汀是一種雙功能烷化劑，具有拮抗腫瘤，殺滅或抑制細(xì)胞發(fā)育的功能。其機(jī)制是利用藥物的烷化功能，使DNA單、雙鏈交叉結(jié)合，干擾DNA的功能與合成，進(jìn)而使腫瘤的生長趨勢減緩[6]。在體內(nèi)藥物動(dòng)力學(xué)中，藥物可以在人的紅細(xì)胞中自由分布，不會(huì)抑制人肝微粒體酶，且無蓄積。從而表明，其安全性高，對腫瘤細(xì)胞具有針對性，因此具有良好的推廣前景。

目前該藥物在我國尚未得到大范圍推廣應(yīng)用，國內(nèi)對鹽酸苯達(dá)莫司汀藥品質(zhì)量的檢測標(biāo)準(zhǔn)還未成型，參閱相關(guān)資料文獻(xiàn)[7-8]，采用HPLC儀器，探索出一種測定鹽酸苯達(dá)莫司汀純度及降解破壞的方法。本研究就鹽酸苯達(dá)莫司汀在各種破壞的情況下，了解降解產(chǎn)物的情況，從而為其后期的穩(wěn)定性等試驗(yàn)提供一定的參考價(jià)值。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters2695分離系統(tǒng)，2996檢測器，Empower色譜管理系統(tǒng)；烘箱(太倉市華利達(dá)，ZDF-6021)；電子天平(梅特勒-托利多，XP205)；強(qiáng)光照射試驗(yàn)箱(重慶市永生，SHH-300GD-2)；水浴鍋(上海宜昌儀器，XMTD-6000)

1.2 試藥

鹽酸苯達(dá)莫司汀中試樣品(深圳萬樂藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)：191202)；氮甲基吡咯烷酮(NMP)(上海躍進(jìn)，色譜純，19010738)；鹽酸(西隴科學(xué)，AR，190327)；氫氧化鈉(廣東省化學(xué)試劑，AR，20171227)；乙腈(默克，色譜純，JB086630)；三氟乙酸(TFA)(上海麥克林,色譜純，C10672543)；30%過氧化氫(西隴科學(xué)，AR，190327)

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 HPLC檢測條件

采用高效液相色譜法(HPLC),選擇ZORBAX BONUS-RP(4.6 x150mm，5um) 色譜柱，流動(dòng)相A：0.1%TFA水溶液,流動(dòng)相B：0.1%TFA乙腈溶液，稀釋劑：以NMP-0.1%TFA水溶液(1：1)，流速：為1.0 mL/min，波長：254 nm，時(shí)長：45 min。同時(shí)按照表1序列進(jìn)行梯度洗脫。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫表

2.2 鹽酸苯達(dá)莫司汀樣品純度分析

稱取本品適量，加稀釋劑NMP-0.1%TFA水溶液溶解成每1 mL約含0.5mg的溶液。同法配制空白。取供試品溶液20μL，注入色譜儀，記錄色譜圖。

圖2 鹽酸苯達(dá)莫司汀純度分析色譜圖-空白

圖3 鹽酸苯達(dá)莫司汀純度分析色譜圖-樣品

從圖可以發(fā)現(xiàn)，鹽酸苯達(dá)莫司汀樣品在17分鐘左右開始出峰，并且可以看出其峰面積非常大，峰形較好，基本沒有雜質(zhì)峰的出現(xiàn)。通過峰面積歸一化法，我們可以看出鹽酸苯達(dá)莫司汀樣品的純度分析非常高，含量高達(dá)99.8%。

2.3 破壞性實(shí)驗(yàn)分析

通過對鹽酸苯達(dá)莫司汀的純度分析，我們了解到其純度非常高。但是，外界或內(nèi)部的影響是否會(huì)對它在成影響，這還是需要進(jìn)行下一步的研究。同時(shí)，文獻(xiàn)查閱可知，對于發(fā)現(xiàn)未知的降解產(chǎn)物，了解降解途徑，其方法思路都是通過強(qiáng)制破壞性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的。并且了解分子內(nèi)在的穩(wěn)定性，認(rèn)證所使用分析方法的有效性。所以，通過對鹽酸苯達(dá)莫司汀進(jìn)行破壞性的實(shí)驗(yàn)研究，從而為后期臨床使用與存放提供參考[9-10]。

2.3.1 酸破壞實(shí)驗(yàn)

室溫條件下，精密稱取，鹽酸苯達(dá)莫司汀樣品約12.5 mg，置25mL容量瓶中。加鹽酸溶液(1 mol/L)1mL，浸潤潤濕后，并按照同樣的方法調(diào)配空白溶液。之后，將調(diào)配好的樣品與空白溶液于60℃水浴放置1h。水浴過后，取出樣品與空白溶液并冷卻至室溫。之后，滴加氫氧化鈉溶液(1 mol/L)調(diào)節(jié)PH至中性，加稀釋劑NMP-0.1%TFA水溶液定容至刻度，同法調(diào)配空白溶液的pH至中性(防止劇烈條件對儀器損壞)。量取酸破壞溶液及空白各20μL，注入色譜儀，記錄鹽酸苯達(dá)莫司汀樣品變化的色譜圖。

圖4 鹽酸苯達(dá)莫司汀酸破壞色譜圖—空白

圖5 鹽酸苯達(dá)莫司汀酸破壞色譜圖-樣品

從圖可以看出，鹽酸苯達(dá)莫司汀樣品經(jīng)過1 mol/L的鹽酸溶液破壞后，在HPLC色譜圖上有A，B兩個(gè)明顯的降解峰，且這兩個(gè)雜質(zhì)峰在鹽酸苯達(dá)莫司汀樣品色譜圖中并未出現(xiàn)，為新雜質(zhì)峰。歸一化法計(jì)算得到：A，B的雜質(zhì)含量分別為5.22%，7.19%，明顯超出ICH規(guī)定的單個(gè)雜質(zhì)限度(單個(gè)雜質(zhì)%<0.1)，從而說明鹽酸苯達(dá)莫司汀樣品在酸性環(huán)境下會(huì)產(chǎn)生大量的降解雜質(zhì)，所以鹽酸苯達(dá)莫司汀產(chǎn)品在后期的保存中應(yīng)避免處于酸性環(huán)境下。

2.3.2 堿破壞實(shí)驗(yàn)

室溫條件下，精密稱取，鹽酸苯達(dá)莫司汀供試品約10.0 mg，置20 mL容量瓶中。同時(shí)，加氫氧化鈉溶液(1 mol/L)1mL，浸潤潤濕后，并按照同樣的方法調(diào)配空白溶液。然后，將調(diào)配好的樣品與空白溶液室溫暗處放置5h。5小過后，滴加鹽酸溶液(1 mol/L)調(diào)節(jié)PH至中性，加稀釋劑NMP-0.1%TFA水溶液稀釋至刻度，同法調(diào)配空白溶液pH至中性。量取堿破壞溶液及空白各20μL，注入色譜儀，記錄鹽酸苯達(dá)莫司汀樣品變化的色譜圖。

圖6 鹽酸苯達(dá)莫司汀堿破壞色譜圖-空白

圖7 鹽酸苯達(dá)莫司汀堿破壞色譜圖-樣品

從圖可以看出，鹽酸苯達(dá)莫司汀樣品經(jīng)過1mol/L的氫氧化鈉溶液破壞后，在HPLC圖譜上有六個(gè)明顯降解雜質(zhì)峰，其中C，D，E，F(xiàn)降解峰在以前的色譜圖中均未出現(xiàn)，屬于新型雜質(zhì)峰；而雜質(zhì)峰A，B在酸破壞的圖譜中就已存在，但峰面積明顯減小。歸一化法計(jì)算得到：A，B，C，D，E，F(xiàn)的雜質(zhì)含量分別為0.55%，1.43%，0.36%，0.61%，1.33%，0.89%。從而說明鹽酸苯達(dá)莫司汀樣品在堿性環(huán)境下會(huì)產(chǎn)生大量的降解雜質(zhì)，所以鹽酸苯達(dá)莫司汀產(chǎn)品在后期的保存中應(yīng)避免處于堿性環(huán)境下。

2.3.3 氧化破壞實(shí)驗(yàn)

室溫條件下，精密稱取，鹽酸苯達(dá)莫司汀樣品約12.5 mg，置25 mL容量瓶中。然后，加入30%過氧化氫濃溶液(30%)1 mL，浸潤潤濕后，并按照同樣的方法調(diào)配空白溶液。之后，將調(diào)配好的樣品與空白溶液，室溫暗處放置2.5 h。之后，加稀釋劑NMP-0.1%TFA水溶液稀釋至刻度。量取氧化破壞溶液及空白各20μL，注入色譜儀，記錄鹽酸苯達(dá)莫司汀樣品變化的色譜圖。

圖8 鹽酸苯達(dá)莫司汀氧化破壞色譜圖-空白

圖9 鹽酸苯達(dá)莫司汀氧化破壞色譜圖-樣品

從圖可以看出，鹽酸苯達(dá)莫司汀樣品經(jīng)過30%的過氧化氫溶液破壞后，在HPLC圖譜上有六個(gè)明顯降解雜質(zhì)峰，其中G，H，I，G，K降解峰在以前的色譜圖中均未出現(xiàn)，而且雜質(zhì)峰H的峰面積最大，屬于新型雜質(zhì)峰；而雜質(zhì)峰A在酸破壞的圖譜中就已存在，但峰面積明顯減小。歸一化法計(jì)算得到：A，G，H，I，J，K的雜質(zhì)含量分別為0.13%，0.10%，7,4 %，1.54 %，0.56%，0.2%。從而說明鹽酸苯達(dá)莫司汀樣品在在氧化條件下會(huì)產(chǎn)生大量的降解雜質(zhì)，所以鹽酸苯達(dá)莫司汀產(chǎn)品在后期的保存中應(yīng)進(jìn)行密閉保存，防止其被氧化。

2.3.4 高溫破壞實(shí)驗(yàn)

(1)高溫破壞實(shí)驗(yàn)(溶液樣品)：

室溫條件下，精密稱取，鹽酸苯達(dá)莫司汀樣品約12.5 mg，置25 mL容量瓶中。加稀釋劑NMP-0.1%TFA水溶液溶解并定容至25 mL，于40℃水浴中20分鐘，放冷至室溫，即得高溫破壞溶液。同法制備空白溶液。量取高溫破壞溶液及空白各20 μL注入色譜儀，記錄鹽酸苯達(dá)莫司汀樣品變化的色譜圖。

圖10 鹽酸苯達(dá)莫司汀高溫破壞實(shí)驗(yàn)-溶液空白色譜圖

圖11 鹽酸苯達(dá)莫司汀高溫破壞實(shí)驗(yàn)-溶液樣品色譜圖

從圖可以看出，鹽酸苯達(dá)莫司汀樣品經(jīng)過在40℃水浴放置20分鐘破壞后，在HPLC色譜圖上有六個(gè)明顯的雜質(zhì)峰，其中雜質(zhì)峰H，K在以前的色譜圖中就已出現(xiàn)，且雜質(zhì)峰H的峰面積在經(jīng)過高溫破壞后，超越了先前氧化破壞的峰面積。而雜質(zhì)峰L，M，N，O在以前的色譜中均未出現(xiàn)，屬于新型雜質(zhì)峰。歸一化法計(jì)算得到，L，H，K，M，N，O的雜質(zhì)含量分別為0.52%，11.64%，0.12 %，0.15 %，0.21%，0.14%。從而說明，鹽酸苯達(dá)莫司汀溶液樣品在高溫環(huán)境下非常不穩(wěn)定，并產(chǎn)生大量的降解雜質(zhì)。因此，鹽酸苯達(dá)莫司汀溶液樣品應(yīng)放置陰涼處存放。

(2)高溫破壞實(shí)驗(yàn)(固體樣品)：

室溫條件下，取本品適量，在130℃烘箱放置8h后。冷卻至室溫，稱取鹽酸苯達(dá)莫司汀樣品約12.5 mg，置25 mL容量瓶中。加稀釋劑NMP-0.1%TFA水溶液溶解，定容至刻度，即得高溫破壞溶液。量取高溫破壞溶液及空白各20 μL，注入色譜儀，記錄鹽酸苯達(dá)莫司汀樣品變化的色譜圖。

圖12 鹽酸苯達(dá)莫司汀高溫破壞實(shí)驗(yàn)-固體空白色譜圖

圖13 鹽酸苯達(dá)莫司汀高溫破壞實(shí)驗(yàn)-固體樣品色譜圖

從圖看出，鹽酸苯達(dá)莫司汀樣品經(jīng)過在130℃烘箱放置8小時(shí)破壞后，色譜圖中出現(xiàn)較多的雜質(zhì)峰，除了雜質(zhì)O和雜質(zhì)K在之前的色譜圖出現(xiàn)過，其他的均為新型雜質(zhì)峰。根據(jù)峰面積歸一化法計(jì)算得到，圖譜中的雜質(zhì)含量總和約為2.51%，主峰峰面積則為97.49%。從而說明，鹽酸苯達(dá)莫司汀固體樣品長期處于高溫環(huán)境下，會(huì)影響后期的穩(wěn)定性。所以，鹽酸苯達(dá)莫司汀樣品應(yīng)避免長期處于高溫環(huán)境。

2.3.5 光照破壞實(shí)驗(yàn)

(1)光照破壞實(shí)驗(yàn)(固體樣品)：室溫條件下，取適當(dāng)樣品，在日光燈10000lx下放置5天，90 uW/cm2，1天。兩個(gè)循環(huán)以后，取本品12.5 mg，加稀釋劑NMP-0.1%TFA水溶液溶解并稀釋至25 mL即得光照破壞溶液。量取高溫破壞溶液及空白各20 μL，注入色譜儀，記錄鹽酸苯達(dá)莫司汀樣品變化的色譜圖。

圖14 鹽酸苯達(dá)莫司汀光照破壞-固體空白色譜圖

圖15 鹽酸苯達(dá)莫司汀光照破壞-固體樣品色譜圖

從圖看出，鹽酸苯達(dá)莫司汀固體樣品經(jīng)過在日光燈10000lx下放置5天，90 uW/cm2，1天，兩個(gè)循環(huán)以后。色譜圖中并未出現(xiàn)降解雜質(zhì)，從而說明光照對鹽酸苯達(dá)莫司汀固體樣品的影響不大。

(2)光照破壞試驗(yàn)(溶液樣品)：精密稱取本品12.5 mg，加稀釋劑NMP-0.1%TFA水溶液溶解并稀釋至25 mL，在日光燈10000lx下放置5天，90 uW/cm2，1天，即得光照破壞溶液。并按照同樣的方法調(diào)配空白溶液。量取高溫破壞溶液及空白各20 μL，注入色譜儀，記錄鹽酸苯達(dá)莫司汀樣品變化的色譜圖。

圖16 鹽酸苯達(dá)莫司汀光照破壞-溶液空白色譜圖

圖17 鹽酸苯達(dá)莫司汀光照破壞-溶液樣品色譜圖

從圖可看出，鹽酸苯達(dá)莫司汀樣品經(jīng)過在日光燈10000lx下放置5天，90 uW/cm2，1天，兩個(gè)循環(huán)處理以后。圖譜出現(xiàn)了大量雜質(zhì)，且種類和數(shù)量明顯增加。根據(jù)峰面積歸一化法計(jì)算得到，主峰峰面積僅有91.02%，其他雜質(zhì)總和為8.98%。從而說明，鹽酸苯達(dá)莫司汀溶液樣品在強(qiáng)光環(huán)境下，會(huì)產(chǎn)生大量的雜質(zhì)。因此，鹽酸苯達(dá)莫司汀溶液樣品應(yīng)在涼暗處存放和使用。

3 總結(jié)與討論

鹽酸苯達(dá)莫司汀試樣與其所含的雜質(zhì)可以通過HPLC法進(jìn)行分離檢測，最終能夠采用峰面積歸一化法得到鹽酸苯達(dá)莫司汀的純度含量；

鹽酸苯達(dá)莫司汀的破壞性試驗(yàn)結(jié)果如下：

(1)酸破壞實(shí)驗(yàn)：其表明，酸對于鹽酸苯達(dá)莫司汀樣品的純度影響較大，產(chǎn)生兩個(gè)雜質(zhì)峰，且含量較大。因此，鹽酸苯達(dá)莫司汀樣品應(yīng)避免處于這種環(huán)境中。

(2)堿破壞實(shí)驗(yàn)：其表明，堿對于鹽酸苯達(dá)莫司汀樣品的純度影響比較大，產(chǎn)生六個(gè)雜質(zhì)，相比酸破壞，其種類和數(shù)量明顯增加。所以，鹽酸苯達(dá)莫司汀樣品應(yīng)避免處于這種環(huán)境中。

(3)氧化破壞實(shí)驗(yàn)：其表明，過氧化氫對于鹽酸苯達(dá)莫司汀樣品的破壞性更大，種類和數(shù)量較于酸堿破壞，都明顯增加。故鹽酸苯達(dá)莫司汀樣品應(yīng)密閉存放，防止氧化。

(4)高溫破壞實(shí)驗(yàn)：其表明，鹽酸苯達(dá)莫司汀固體樣品長期處于高溫狀態(tài)下，會(huì)產(chǎn)生降解。同時(shí)，高溫對鹽酸苯達(dá)莫司汀溶液樣品的純度影響則更明顯，雜質(zhì)數(shù)量也明顯增多。因此鹽酸苯達(dá)莫司汀樣品應(yīng)避免長期處于高溫狀態(tài)下。

(5)光照破壞實(shí)驗(yàn)：其實(shí)表明，鹽酸苯達(dá)莫司汀固體樣品不受光照破壞的影響，但是鹽酸苯達(dá)莫司汀溶液樣品則受光照影響較大。故鹽酸苯達(dá)莫司汀樣品的使用和存放應(yīng)盡量避免強(qiáng)光照射。

結(jié)論：酸度破壞，堿度破壞，氧化破壞以及高溫對鹽酸苯達(dá)莫司汀樣品的純度影響十分明顯，并且產(chǎn)生了大量的降解物雜質(zhì)，降解物雜質(zhì)種類和數(shù)量繁多。光照破壞對于鹽酸苯達(dá)莫司汀固體樣品幾乎沒有影響，但對于溶液樣品影響巨大。所以，鹽酸苯達(dá)莫司汀應(yīng)當(dāng)避免置于此類環(huán)境之中。對于造成其不穩(wěn)定的原因，經(jīng)過初步分析是由于結(jié)構(gòu)的特殊性導(dǎo)致的。如結(jié)構(gòu)中的氮芥群和丁酸側(cè)鏈，雖然它們賦予了鹽酸苯達(dá)莫司汀完整的烷基化作用，但也使得其更易受外界環(huán)境的影響。

同時(shí)，通過HPLC譜圖分析可知，鹽酸苯達(dá)莫司汀樣品出峰時(shí)間，出峰高度，降解產(chǎn)物以及其他雜質(zhì)峰之間存在和較大的區(qū)別，二者能夠進(jìn)行分離檢出，從而進(jìn)一步驗(yàn)證了該法的可行性。