響應(yīng)面優(yōu)化超聲輔助提取巧克力中礦物油工藝及檢測

趙曉丹，李巧玲

（河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊050018）

礦物油（mineral oil）作為石油的副產(chǎn)物，常被稱為白油或者是石蠟油[1]。由于其被人體攝入易在體內(nèi)富集，所以食用摻有一定量礦物油的食品就會對人體造成危害。食品中礦物油和傳統(tǒng)意義上的污染物有所不同，不僅不易揮發(fā)而且組成非常復(fù)雜，是C10～C50烴類化合物總稱，主要分兩大類，一類是以多芳香化合物形式存在的芳香烴礦物油（mineral oil aromatic hydrocarbons，MOAH），另一類為飽和烴礦物油（mineral oil saturated hydrocarbons，MOSH），其具有支鏈、直鏈和環(huán)狀結(jié)構(gòu)[2-4]。其中，致癌和致突變的主要來源是具有4～6環(huán)結(jié)構(gòu)的多環(huán)芳烴礦物油[5-7]。礦物油的毒性和它的黏度已證明存在一定的關(guān)系，黏度越高的礦物油毒副作用越不明顯，而有非常明顯毒害作用的是低黏度礦物油[8-9]。

目前，國際上檢測礦物油多采用液相色譜與氣相色譜聯(lián)用，國內(nèi)劉玲玲等[10]建立了高效液相色譜-氣相色譜聯(lián)用測定稻谷和大米中飽和烴礦物油（MOSH）的方法，但該檢測方法儀器昂貴，無法普及。劉亮等[11]采用氣相色譜-質(zhì)譜法檢測雞肉中的礦物油，雖然質(zhì)譜定量準確，但是礦物油結(jié)構(gòu)復(fù)雜，信息不足，難以定量。本文對巧克力中礦物油進行超聲輔助提取，并進一步通過響應(yīng)面法優(yōu)化，得到最優(yōu)提取工藝，分離純化時用硝酸銀硅膠固相萃取柱，檢測時采用氣相色譜（gas chromatography，GC）（配備氫火焰離子化檢測器），該提取檢測方法操作簡單，定量準確，對試驗條件和儀器要求不高，可為后續(xù)食品中礦物油的日常提取檢測提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

氣相色譜儀（GC-7820A，配備氫火焰離子化檢測器）：美國 Agilent公司；超聲波清洗器（SK5200LHC）：上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；高速冷凍離心機（KDC-160HR）：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

正己烷（色譜純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；硅膠（0.063 mm～0.200 mm）：上海麥克林生化科技有限公司；C7～C40正構(gòu)烷烴混合標準溶液、環(huán)己基環(huán)己烷（cyclohexylcychlohexane，Cycy，用作內(nèi)標）：美國Sigma-Aldrich公司；AgNO3（分析純）：上海精細化工材料研究所；巧克力：市購。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液

10 mg/mL內(nèi)標儲備液中準確移取0.5 mL于25 mL棕色容量瓶內(nèi)，用正己烷定容，得濃度為200 mg/L的內(nèi)標使用液。

準確移取濃度為1 mg/mL的C7～C40正構(gòu)烷烴混合標準溶液1 mL于5 mL的棕色容量瓶中定容，得到200 mg/L標準工作液；以此方法分別配制200、40、8、1.6 mg/L以及0.32 mg/L的系列標準工作液[12]。

1.2.2 礦物油的提取工藝及優(yōu)化

準確稱取3 g切碎的巧克力樣品于錐形瓶中，以正己烷為溶劑，加入30 μL內(nèi)標使用液，在超聲輔助條件下對樣品提取3次，然后將其離心15 min（轉(zhuǎn)速8 000 r/min），取上清液氮吹濃縮至2 mL，得樣品提取液[13]。

1.2.2.1 礦物油提取的單因素試驗

根據(jù)預(yù)試驗，分別設(shè)定超聲輔助提取時間25 min、溫度30℃、料液比 1∶3（g/mL）、功率 120 W，采用控制變量法考查不同條件下巧克力樣品中礦物油提取量的變化。

1.2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化礦物油提取工藝

在前期的單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，選取單因素試驗中各最佳因素條件為中間水平，以礦物油提取量為響應(yīng)值，設(shè)計四因素三水平的Box-Behnken試驗方案[14]，如表1所示。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Experimental design and variable levels for Box-Behnken

1.2.3 樣品凈化

按文獻[15]制備固相萃取柱（solid phase extraction，SPE）柱，將玻璃纖維濾紙放入5 mL玻璃注射器底部，加入3 g 0.3%銀漬硅膠后敲實，銀漬硅膠表面再放一層玻璃纖維濾紙。用10 mL正己烷淋洗，棄去流出液，待液面接近填料時，加入1.2.2中的2 mL提取液，以15 mL正己烷洗脫，棄去最初2 mL洗脫液，收集后續(xù)10 mL，氮吹濃縮至1 mL，備用。

1.2.4 色譜條件

1.2.5 檢出限和定量限

將標準工作液進一步稀釋，相同條件下取各低濃度的工作液檢測6次，由yd=3.3×σb，yq=10×σb可得檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantification，LOQ），式中：yd、yq分別為 LOD、LOQ 處的信號響應(yīng)值；σb為標準曲線最低濃度點的標準偏差[16]。

表2 色譜條件Table 2 Chromatographic conditions

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果與分析

2.1.1 提取時間對礦物油提取量的影響

提取時間對礦物油提取量的影響見圖1。

圖1 提取時間對礦物油提取量的影響Fig.1 Effect of extraction time on extraction quantity of mineral oil

由圖1可知，隨提取時間增加，礦物油提取量增加，但當(dāng)超過25 min后，提取量略有減少。主要因為提取時間越長，越有利于巧克力中礦物油擴散至提取液中，達到平衡后繼續(xù)增加提取時間將會增加體系的不穩(wěn)定性，導(dǎo)致提取量降低[17]?？紤]到實際應(yīng)用，在后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗中選提取時間為20 min～30 min。

2.1.2 提取溫度對礦物油提取量的影響

提取溫度對礦物油提取量的影響見圖2。

常州市人才工作起步較早，黨管人才工作運行機制完善，人才隊伍建設(shè)政策體系和服務(wù)體系相對完善，人力資源發(fā)展氛圍好、基礎(chǔ)扎實。截至2016年年底，全市人才總量達到106.2萬人，其中高層次人才6.28萬人，高技能人才26.2萬人，分別比2010年增加了68.04%，117.29%，142.17%。2015年，每萬人口中大學(xué)本科及以上學(xué)歷人數(shù)219人，位列全省第三；每萬從業(yè)人員中研究與發(fā)展（R&D）人員數(shù)233人，位列全省第二。企業(yè)R&D活動人員占企業(yè)職工比重6.78%，R&D活動人員占科技活動人員比重67.82%，位列全省第五。

圖2 提取溫度對礦物油提取量的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction quantity of mineral oil

從圖2中可以看出，當(dāng)提取溫度未超過30℃時，礦物油提取量隨溫度升高而快速上升，在此之后溫度升高提取量開始下降。雖然溫度升高有助于加速分子運動，但是當(dāng)體系達到平衡后，溫度對礦物油提取量的影響不明顯，反而會使溶劑揮發(fā)且浪費熱源，此外高溫還可能導(dǎo)致礦物油的揮發(fā)，因此將20℃～40℃作為理想的提取溫度進行后續(xù)優(yōu)化。

2.1.3 料液比對礦物油提取量的影響

料液比對礦物油提取量的影響見圖3。

圖3 料液比對礦物油提取量的影響Fig.3 Effect of material-liquid ratio on extraction of mineral oil

根據(jù)圖 3 可知，在料液比在 1∶1（g/mL）～1∶3（g/mL）范圍，礦物油提取量逐步增加，當(dāng)溶劑體積超過3倍時，提取量略有下降。由于溶劑添加量太少，提取物溶出困難，導(dǎo)致提取量不高；當(dāng)溶劑添加量過多時，超聲空化作用減?。涣硗馊軇w積過大，造成資源浪費，且后續(xù)氮吹濃縮時間變長，導(dǎo)致礦物油損失[18]。由此可見，應(yīng)將 1 ∶2（g/mL）～1∶4（g/mL）作為理想的料液比范圍進行后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化。

2.1.4 超聲功率對礦物油提取量的影響

超聲功率對礦物油提取量的影響見圖4。

圖4 超聲功率對礦物油提取量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on extraction of mineral oil

由圖4中看出，超聲功率介于80 W～120 W之間，礦物油提取量逐步增加，此后提取量呈下降的趨勢，可能由于超聲有其獨特的力學(xué)、熱學(xué)及空化效應(yīng)等物理化學(xué)效應(yīng)會對礦物油提取量造成一定的影響。因此選擇100 W～140 W作為理想的超聲功率范圍并進行后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗

利用Design-Expert進行試驗設(shè)計及數(shù)據(jù)處理，試驗結(jié)果見表3，擬合表中數(shù)據(jù)，建立數(shù)學(xué)模型，得到回歸方程為：Y=4.63+0.29A+0.10B+0.40C-0.11AB-0.044AC+0.13AD-0.032D+0.018BC-0.096BD-0.020CD-0.60A2-0.70B2-0.53C2-0.61D2。

表3 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Experimental design and results of Box-Behnken

回歸模型方差分析見表4。

由表4可知：模型P＜0.000 1，失擬項P=0.058 8，說明這個二次方程模型極顯著，回歸模型擬合度好，試驗誤差小。其中R2=0.983 1＞0.9，試驗?zāi)Ｐ偷男Ｕ禂?shù)R2Adj=0.966 1，說明可以用此模型對巧克力中提取礦物油進行分析和預(yù)測。結(jié)果表明，該模型中A、D、A2、B2、C2、D2和B、AD對礦物油提取量影響分別達到極顯著水平和顯著水平[19]。

表4 回歸模型方差分析表Table 4 Variance analysis for the fitted quadratic polynomial model

各因素交互作用對礦物油提取量的響應(yīng)面圖見圖5。

由圖5及F值大小得各因素對礦物油提取量影響主次順序為料液比＞提取時間＞提取溫度＞超聲功率。以試驗?zāi)Ｐ皖A(yù)測時間、溫度、料液比和超聲功率最佳條件分別為：26.125 min、34.75 ℃、1 ∶3.225（g/mL）和117 W，在此條件下礦物油提取量達到最大值3.215 mg/kg。為進一步驗證該模型的有效性，同時結(jié)合儀器條件將最佳條件分別修改為：26 min、35℃、1 ∶3.2（g/mL）和 120 W，該條件下，礦物油提取量達3.127 mg/kg，和預(yù)測值3.215 mg/kg基本一致，其中相對偏差為2.74%，說明模型很好地預(yù)測了礦物油提取量，該優(yōu)化工藝條件相對可靠[20-21]。

2.3 礦物油定性及定量分析

在1.2.4色譜條件下C7～C40正構(gòu)烷烴混合標準溶液和巧克力中礦物油的色譜圖如圖6所示。

正構(gòu)烷烴C9～C40的分子式、分子量及標準曲線方程見表5。

圖5 各因素交互作用對礦物油提取量的響應(yīng)面圖Fig.5 The response surface map of the interaction of each factor to the extraction amount of mineral oil

圖6 GC色譜圖Fig.6 GC spectra

表5 正構(gòu)烷烴C9～C40的分子式、分子量及標準曲線方程Table 5 Molecular formula，molecular weight and standard curve of normal paraffin C9～C40

續(xù)表5 正構(gòu)烷烴C9～C40的分子式、分子量及標準曲線方程Continue table 5 Molecular formula，molecular weight and standard curve of normal paraffin C9～C40

由于C7、C8發(fā)生揮發(fā)損失，未檢測出相關(guān)譜圖，以GC譜圖中C9～C40正構(gòu)烷烴混合標準工作液的峰面積（y）與相應(yīng)濃度（x）繪制曲線，所得相應(yīng)標準曲線的相關(guān)系數(shù)均趨近于1，說明C9～C40正構(gòu)烷烴混合標準工作液在0.32 mg/L～200 mg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

采用標準曲線和內(nèi)標法結(jié)合法進行定性定量分析，得到待測樣品中礦物油種類及含量，內(nèi)標法計算待測樣品中礦物油含量（mi）公式如下：

mi=f×Ai（As/ms）

式中：Ai和As分別為待測樣品中礦物油和內(nèi)標物的峰面積或峰高；ms為加入內(nèi)標物的量，mg/L；f為相對校正因子。

f=（As/ms）/（Ar/mr）

式中：As和Ar分別為內(nèi)標物和混合標準溶液中礦物油的峰面積或峰高；ms和mr分別為加入內(nèi)標物和混合標準溶液中礦物油的量，mg/L[22]。

2.4 檢出限和定量限

由1.2.5計算得該檢測方法的LOD和LOQ分別為0.26 mg/kg和0.78 mg/kg，可滿足日常檢測需求。

2.5 加標回收率

在試驗1.2的基礎(chǔ)上，將巧克力作為基質(zhì)，分別添加 1.5、3.0、6.0 mg/kg 的 C7～C40正構(gòu)烷烴混合標準溶液進行加標回收試驗并檢測，得加標回收率為85.2%～97.4%，相對標準偏差在0.37%～1.33%之間，滿足分析檢測的要求[23]。

2.6 樣品分析

對市售的10種巧克力樣品進行分析檢測，結(jié)果見表6。

結(jié)果表明，10種巧克力樣品中均能檢測到礦物油，平均含量介于1.047 mg/kg～7.073 mg/kg之間，其中2號和6號樣品中礦物油含量較高，污染來源可能是生產(chǎn)過程中使用含有礦物油的脫模劑和防黏劑，也可能源于包裝材料上礦物油的遷移。但是目前國內(nèi)對巧克力中礦物油含量沒有明確的限量要求，隨著人們對礦物油毒理學(xué)的認識，巧克力中礦物油污染問題逐漸引起了廣泛的關(guān)注。

表6 不同巧克力樣品中的礦物油含量Tab.6 Mineral oil content in different chocolate samples

3 結(jié)論

本研究采用超聲輔助提取巧克力中的礦物油，并通過響應(yīng)面優(yōu)化，得最佳提取條件：提取時間26 min，提取溫度35℃，料液比1∶3.2（g/mL），超聲功率120 W。氣相色譜檢出限為0.26 mg/kg，定量限為0.78 mg/kg，加標回收率為85.2%～97.4%，相對標準偏差在0.37%～1.33%之間，采用該提取檢測方法測定了市售10種巧克力樣品中的礦物油含量，結(jié)果表明，10種巧克力樣品中均存在礦物油污染的情況，礦物油平均含量介于1.047 mg/kg～7.073 mg/kg之間，本課題組將繼續(xù)深入研究探討巧克力中礦物油的污染和遷移問題，為食品監(jiān)管及立法提供數(shù)據(jù)支持。