PTEN/PI3K/AKT通路緩解糖尿病視網(wǎng)膜病變的機制

楊麗娜 方肖云

(浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院，浙江 杭州 312500)

糖尿病視網(wǎng)膜病變是糖尿病最為嚴重、常見且對視力功能有嚴重影響的眼部并發(fā)癥，是糖尿病患者致盲的主要原因之一〔1〕。視網(wǎng)膜病變后視神經(jīng)元凋亡是導致患者視功能不佳甚至失明的主要原因，故找到一種抑制視網(wǎng)膜病變后光感受器細胞凋亡的方法，對改善糖尿病視網(wǎng)膜病變患者的視功能及降低失明風險意義重大〔2，3〕。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)育期的視網(wǎng)膜節(jié)細胞中有第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源物基因(PTEN)優(yōu)先定位〔4〕。PTEN參與神經(jīng)元凋亡的過程，作為一種主要的神經(jīng)元凋亡調(diào)節(jié)因素，PTEN具有蛋白磷酸酶與脂質(zhì)磷酸酶雙重活性，作為脂質(zhì)磷酸酶時，可對磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(AKT)信號通路產(chǎn)生負性調(diào)控，抑制細胞生長，加速細胞凋亡〔5〕。Sun等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)，將成年小鼠視網(wǎng)膜上PTEN基因敲除后，視神經(jīng)損傷，但視網(wǎng)膜神經(jīng)元活性增加，認為PTEN的失活是提高皮質(zhì)神經(jīng)元再生能力的主要原因。故推測抑制PTEN影響PI3K/AKT信號通路可能對緩解糖尿病視網(wǎng)膜病變有一定價值，但目前與之相關的研究并不多見。本研究探討PTEN/PI3K/AKT信號通路緩解糖尿病視網(wǎng)膜病變的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 購自甘肅中醫(yī)藥大學科研實驗動物中心的50只SD大鼠，許可證號：SCXK(甘)2019-0001。大鼠周齡均為8 w，雌性25只，雄性25只，雌性與雄性分籠喂養(yǎng)；體重0.20～0.22〔平均(0.21±0.01)〕kg。

1.2主要實驗設備與試劑 北京博愛科貿(mào)生物有限公司提供的鏈脲佐菌素、上海派普泰克生物制劑有限公司提供的內(nèi)皮生長因子、美國Sigma公司提供的雙過氧釩(bpV，PTEN特異性抑制劑)、美國Roche公司提供的TUNEL原位細胞凋亡檢測試劑盒、上海華靈康復器械廠提供的高效切片石蠟、上?；瘜W試劑公司提供的各類化學試劑，如多聚甲醛、二甲苯等、日本Olympus公司提供的熒光顯微鏡、光學顯微鏡，美國Cell Signaling公司提供的兔抗大鼠AKT單克隆抗體、p-AKT單克隆抗體，美國Abcam公司提供的兔抗大鼠B細胞淋巴瘤(Bcl)-2多克隆抗體、胞質(zhì)細胞色素(Cyt)C多克隆抗體、磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)依賴性激酶(p-PDK)1多克隆抗體、鼠抗人半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3單克隆抗體及胞質(zhì)蛋白制備試劑盒，其他細胞裂解液、蛋白濃度檢測試劑盒等均由碧云天生物試劑提供。

1.3方法

1.3.1分組方法 SD大鼠50只，隨機抽取10只作為空白對照組，其余40只作為模型組建立糖尿病視網(wǎng)膜病變模型，視網(wǎng)膜病變大鼠模型均為增殖期。建模后隨機抽取10只大鼠納入安慰劑組，為其視網(wǎng)膜下注射安慰劑，其他30只大鼠視網(wǎng)膜下注射bpV隨機分為3組，bpV使用劑量分別為40 ng/kg、400 ng/kg、4 000 ng/kg。每組10只大鼠，動物的使用均符合視覺與眼科研究協(xié)會2014年年會提出的有關實驗動物使用的相關條款〔7〕。全部大鼠在12 h白晝/12 h夜晚的環(huán)境下喂養(yǎng)，環(huán)境濕度55%～60%，溫度：22～25℃。

1.3.2糖尿病視網(wǎng)膜病變建模方法 大鼠適應性喂養(yǎng)7 d后，模型組腹腔內(nèi)注射60 mg/kg鏈脲佐菌素液，注射前禁食16 h，不禁水，注射3 d后檢測空腹血糖值，若≥16.7 mmol/L則判定為糖尿病；在成功建立糖尿病模型后，使用微量進樣器抽取內(nèi)皮生長因子0.05 μg，于大鼠顳側(cè)角膜后緣2 mm水平處經(jīng)睫狀體平坦部位向玻璃體腔內(nèi)注射，進樣器緩慢推進并留針10 s，28 d后分批對模型組進行眼底熒光造影檢查，若造影結(jié)果顯示血管擴張迂曲、背景熒光增強、新生血管熒光滲漏等影像學表現(xiàn)則視作發(fā)生糖尿病視網(wǎng)膜病變，且病變階段為增殖期，成功建立糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠模型。

1.3.3模型組分組與給藥方法 全部建模成功的40只大鼠中隨機抽取10只納入安慰劑組，在成功建模第4天為其視網(wǎng)膜注射安慰劑，其他30只大鼠均在視網(wǎng)膜下注射bpV，隨機分為3組，劑量分別為40 ng/kg、400 ng/kg、4 000 ng/kg。

1.4相關指標的檢測

1.4.1制備組織切片 模型制作后3 d，使用1%戊巴比妥鈉向大鼠腹腔注射，處死大鼠，大鼠的處理符合中華人民共和國科學技術(shù)部“關于善待實驗動物指導性意見”中的相關意見〔8〕。大鼠處死后在角膜12點位置處做好標記，并保留角膜緣球結(jié)膜，將其他部位球結(jié)膜去除，摘取眼球后放置在眼球固定液中，行脫水、包埋、視神經(jīng)矢狀切片等處理，切片厚度約為5 μm，用于免疫熒光染色操作。將分離得到的視網(wǎng)膜置于液氮內(nèi)保存，進行Western印跡檢測。標本進行脫水、透明、浸蠟、包埋等操作。

1.4.2主要檢測指標與方法 結(jié)合免疫熒光與Western印跡法檢測PTEN在建模后1 d、2 d、3 d、7 d的表達，同時使用熒光凋亡試劑盒檢測視神經(jīng)細胞元凋亡情況，嚴格按照試劑盒進行操作與判別。①免疫熒光檢測p-AKT、p-BAD、Bcl-2：大鼠雙眼球摘取后石蠟切片常規(guī)脫蠟，切片微波抗原修復，緩沖液沖洗，山羊血清內(nèi)封閉，緩沖液沖洗，稀釋孵育過夜，緩沖液沖洗孵育后過夜，復染后再次沖洗，脫水操作后進行透明、封片，在熒光顯微鏡下觀察復染結(jié)果。②Western印跡檢測視網(wǎng)膜p-PDK1、CytC、Caspase-3蛋白水平：配制組織裂解液、緩沖液，提取組織總蛋白，分離線粒體與胞質(zhì)，配制所需液體后進行各項操作，使用軟件檢測Western條帶灰度值，計算各蛋白內(nèi)參β-actin灰度比值。③胞質(zhì)處理后，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗測定PIP3表達。

1.5統(tǒng)計學分析 采用SPSS20.0軟件進行單因素方差分析檢驗、SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1大鼠建模后各時點PTEN表達水平 空白對照組大鼠PTEN表達水平為0.39±0.02，模型組建模后PTEN表達逐漸上調(diào)，建模后1、2 d分別為0.69±0.10，0.81±0.12，在建模后3 d達到峰值，為0.92±0.04，后呈下降趨勢，并在7 d(0.44±0.04)恢復至正常(F=232.456，P<0.001)。

2.2視神經(jīng)元凋亡情況 空白對照組未檢出視神經(jīng)元凋亡。建模后第1天，在模型大鼠外核層(ONL)發(fā)現(xiàn)少量凋亡細胞；第2天、第3天模型組大鼠ONL可見視神經(jīng)元凋亡增加，表達強度增強；在建模成功第4天給予大鼠視網(wǎng)膜bpV注射，建模第7天即bpV注射3 d，此時可見有視神經(jīng)元凋亡數(shù)量減少，表達強度明顯降低，見圖1。

圖1 各組視神經(jīng)元凋亡情況(TUNEL，×100)

2.3各組p-AKT、p-BAD、Bcl-2、p-PDK1、CytC、Caspase-3表達比較 與空白對照組比較，安慰劑組、p-AKT、p-BAD、Bcl-2、p-PDK1、CytC及Caspase-3均明顯降低(P<0.05)。與安慰劑組比較，bpV組p-AKT、p-PDK1、p-BAD、Bcl-2表達顯著升高，胞質(zhì)CytC、Caspase-3表達顯著上調(diào)，且bpV 4 000 ng/kg組>bpV 400 ng/kg組>bpV 40 ng/kg組(P<0.05)。見表1。

表1 各組p-AKT、p-BAD、Bcl-2、p-PDK1、CytC、Caspase-3相對表達檢測結(jié)果比較

3 討 論

糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生與發(fā)展是一個極為復雜的病理過程，引起這種病變發(fā)生的病理原因涉及信號傳導代謝酶、細胞因子、炎癥反應、離子通道等諸多基因異常改變〔9〕。新生血管形成是糖尿病視網(wǎng)膜病變進入增殖期的主要病理特征，故阻斷新生血管的形成是目前糖尿病視網(wǎng)膜病變治療的主要研究靶點〔10〕。

PI3K/AKT信號通路在細胞中廣泛存在，主要作用是通過參與細胞的增殖、生長與分化調(diào)節(jié)來實現(xiàn)，該信號通路在激活的狀態(tài)下可加速內(nèi)皮細胞存活周期，同血管內(nèi)皮生長因子相互作用，介導細胞的遷移、存活、誘導新生血管形成，是一種促存活信號通路〔11〕。AKT是絲氨酸抗凋亡主要信號，可以通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞的細胞周期來介導細胞周期相關蛋白水解并幫助其在細胞內(nèi)定位，達到干擾G1期向S期過渡的目的，發(fā)揮調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞遷移、增殖及血管新生誘導之效〔12〕。而PI3K被激活后，則主要受其第二信使PIP3刺激，產(chǎn)生下游更多信號分子，增強信號通路傳導，進一步增強PI3K通路在內(nèi)皮細胞增殖、遷移、血管生成等病理改變中的作用〔13〕。周賽君等〔14〕研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，因高糖導致的缺氧缺血環(huán)境會激活內(nèi)皮細胞內(nèi)PI3K/AKT信號通路中AKT表達，增加其磷酸化，進而加速新生血管的形成。這種PI3K/AKT信號通路傳導信號增強的機制，被認為可用于指導糖尿病視網(wǎng)膜病變的治療〔15〕。神經(jīng)元凋亡是諸多神經(jīng)疾病包括視網(wǎng)膜病變在內(nèi)的最終結(jié)局，可見抑制視神經(jīng)元凋亡對緩解糖尿病視網(wǎng)膜病變患者病情與抑制病情進一步發(fā)展的關鍵意義〔16〕。PTEN是一個高度保守基因，在人與諸多哺乳動物中，其具有高度的同源性，可見PTEN在細胞生命中的關鍵作用〔17〕；PTEN作為一種脂質(zhì)磷酸酶，可對PI3K/AKT信號通路產(chǎn)生負性調(diào)控，這種負性調(diào)控對細胞的生長有抑制作用，參與細胞凋亡〔18〕。

本研究結(jié)果提示PTEN表達增加可能介導了糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠視神經(jīng)細胞的凋亡，可能是視網(wǎng)膜病變大鼠視功能逐漸減退的原因。故考慮抑制PTEN表達，可能對減輕視神經(jīng)細胞凋亡、緩解疾病進一步進展有積極意義。結(jié)果表明抑制PTEN通路對阻礙糖尿病視網(wǎng)膜病變視神經(jīng)元細胞凋亡有一定應用價值。糖尿病視網(wǎng)膜病變后抑制PTEN能夠重新對PI3K/AKT信號通路活性產(chǎn)生直接激活的效果，增加p-BAD、Bcl-2等表達，發(fā)揮理想的視神經(jīng)保護之效。