miR-378c靶向AKT1調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖、凋亡的機(jī)制

張健博 宋建鋒 武海發(fā)

(永煤集團(tuán)總醫(yī)院骨科，河南 永城 476600)

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種由遺傳、機(jī)械和環(huán)境等多因素引起的復(fù)雜關(guān)節(jié)退行性病變，臨其床表現(xiàn)主要為緩慢發(fā)展的關(guān)節(jié)疼痛、壓痛、僵硬、關(guān)節(jié)腫脹、活動受限和關(guān)節(jié)畸形等〔1〕。OA的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，軟骨細(xì)胞的異常凋亡，導(dǎo)致軟骨的完整性破壞，負(fù)重功能及骨損傷、重塑平衡功能的喪失可能是其發(fā)生的主要原因〔2〕。因此，如何維持軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的動態(tài)平衡是防治OA的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。蛋白激酶B(AKT)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在調(diào)控細(xì)胞存活和凋亡中起重要作用〔3〕。有研究〔4〕發(fā)現(xiàn)，AKT參與關(guān)節(jié)炎的病理過程，磷酸化(p)-AKT在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)。黃連素可通過激活A(yù)KT促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的存活〔5〕。miR-378c是miR-378家族的主要成員，荊琳等〔6〕在研究膝骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨組織與血漿中miRNA表達(dá)變化及意義時發(fā)現(xiàn)，miR-378c在OA軟骨組織中表達(dá)上調(diào)，但miR-378c對骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的增殖和凋亡的影響及miR-378c能否介導(dǎo)AKT1表達(dá)參與調(diào)控OA軟骨細(xì)胞的增殖和凋亡尚未可知。因此，本研究通過檢測miR-378c和p-AKT1在正常軟骨組織和OA軟骨組織中的表達(dá)差異，探討miR-378c靶向AKT1對OA軟骨細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料與主要試劑、儀器 18例OA軟骨組織和18例正常軟骨組織由永煤集團(tuán)總醫(yī)院骨科于2017年1月至2018年1月收集。成人OA-軟骨細(xì)胞HC-OA購于處實(上海)生物科技有限公司。DMEM/F12和胎牛血清(FBS)購于Thermo公司；LipofectamineTM 2000相關(guān)轉(zhuǎn)染試劑和TRIzol試劑購于美國Invitrogen公司；RT-PCR引物、miR-378c抑制物(anti-miR-378c)、miRNA抑制物陽性對照(anti-miR-NC)、小干擾RNA無序陽性對照(si-NC)、AKT1小干擾RNA(si-AKT1)、野生型(WT)-AKT1及突變型(MUT)-AKT1的構(gòu)建和測序由上海生工公司提供；噻唑藍(lán)(MTT)試劑、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、聚偏氟乙烯(PVDF)膜、Western印跡相關(guān)試劑購于北京索萊寶公司；p-AKT1、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)、細(xì)胞周期素(Cyclin)D1、P21、Bax和Bcl-2一抗購于Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗和RIPA裂解液購于上海生工公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于美國Promega公司；SYBR Green PCR試劑盒購于TaKaRa；酶標(biāo)儀和LightCycler 480實時熒光定量PCR儀購自美國Thermo公司；流式細(xì)胞儀購自美國Beckman公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 采用DMEM/F12培養(yǎng)基(含有10% FBS)在37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)人OA軟骨細(xì)胞HC-OA，每隔1 d更換液1次，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到80%時，用胰酶消化后進(jìn)行傳代。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：取對數(shù)期生長良好的HC-OA細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，以2×105個/孔細(xì)胞數(shù)接種于96孔培養(yǎng)板，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到50%時，利用LipofectamineTM2000將anti-miR-378c、anti-miR-NC、si-NC和si-AKT1分別轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞，于細(xì)胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行后續(xù)實驗分析。實驗分組如下：anti-miR-378c組(轉(zhuǎn)染anti-miR-378c)、anti-miR-NC組(轉(zhuǎn)染anti-miR-NC)、si-NC組(轉(zhuǎn)染si-NC)、si-AKT1組(轉(zhuǎn)染si-AKT1)、anti-miR-378c+si-NC組(轉(zhuǎn)染anti-miR-378c和si-NC)和anti-miR-378c+si-AKT1組(轉(zhuǎn)染anti-miR-378c和si-AKT1)。

1.3qRT-PCR檢測 按照TRIzol試劑使用說明從18例正常軟骨組織和18例OA軟骨組織及各組HC-OA細(xì)胞中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，用SYBR Green PCR試劑盒進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，用LightCycler 480系統(tǒng)進(jìn)行信號收集熒光信號并進(jìn)行熔爐曲線分析。以U6作為miR-378c和p-AKT1 mRNA的內(nèi)參，用2-ΔΔCt方法計算miR-378c和p-AKT1 mRNA的相對表達(dá)量。

1.4MTT實驗檢測細(xì)胞增殖活力 取轉(zhuǎn)染24 h的HC-OA細(xì)胞，以細(xì)胞密度為1×104個/孔接種于96孔板進(jìn)行培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)24 h、48 h、72 h時向每個孔中加入20 μl的MTT試劑，室溫反應(yīng)4 h，吸去孔內(nèi)上清液，每孔再加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，緩慢搖動10 min至完全溶解。用酶標(biāo)儀在490 nm波長處檢測各孔的OD值(以空白孔進(jìn)行調(diào)零)。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取各組HC-OA細(xì)胞，用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化后離心，棄上清收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷的1×磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗細(xì)胞，加入適量的1×結(jié)合緩沖液輕輕吹打重懸細(xì)胞，然后加入5 μl的膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)混勻，室溫避光孵育15 min后，加入5 μl的碘化丙啶(PI)染色，隨后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.6雙熒光素酶報告基因檢測 利用靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫Targetscan網(wǎng)站(http：//www.targetscan.org/vert/)預(yù)測miR-378c的靶基因。發(fā)現(xiàn)miR-378c的5′端可與AKT1的3′-UTR特異性結(jié)合，猜測AKT1是miR-378c的靶基因。為驗證這一猜想，構(gòu)建WT-AKT1和MUT-AKT1的AKT13′-UTR熒光素酶報告載體。利用LipofectamineTM 2000將miR-378c和miR-NC分別與WT-AKT1和MUT-AKT1共轉(zhuǎn)染HC-OA細(xì)胞，然后將各組HC-OA細(xì)胞于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，收集各組細(xì)胞，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書對各組HC-OA細(xì)胞的熒光素酶活性進(jìn)行檢測。

1.7Western印跡檢測 按照用RIPA裂解液使用說明書裂解各組HC-OA細(xì)胞和正常軟骨組織和OA軟骨組織，收集細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。用十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用洗滌液洗膜后加入封閉液室溫封閉1 h，吸盡封閉液，加入相應(yīng)的抗p-AKT1、GAPDH、CyclinD1、P21、Bax和Bcl-2一抗(1：1 000)4℃孵育過夜，用洗滌液洗膜3次，每次10 min，隨后加入稀釋好的HRP標(biāo)記的二抗(1：1 000)室溫孵育2 h，再次洗膜3次后于暗室加入顯影液進(jìn)行顯色并拍照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶光密度值(以GAPDH作為內(nèi)參)。

1.8數(shù)據(jù)處理 采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS20.0進(jìn)行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-378c、AKT1在OA患者軟骨組織和健康人正常軟骨組織中的表達(dá) 與正常軟骨組織相比，OA軟骨組織中miR-378c表達(dá)顯著升高，p-AKT1蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 軟骨組織p-AKT1蛋白的表達(dá)

表1 miR-378c、AKT1在OA軟骨組織和正常軟骨組織中的表達(dá)

2.2抑制miR-378c表達(dá)對HC-OA細(xì)胞增殖的影響 anti-miR-378c組中miR-378c的表達(dá)顯著低于anti-miR-NC組(P<0.05)，表明成功構(gòu)建了抑制miR-378c表達(dá)的HC-OA細(xì)胞株。與anti-miR-NC組相比，anti-miR-378c組中HC-OA細(xì)胞在24 h、48 h、72 h時的細(xì)胞活力顯著升高，CyclinD1蛋白的表達(dá)顯著升高，P21蛋白的表達(dá)顯著減低(P<0.05)。見圖2、表2。

2.3抑制miR-378c表達(dá)對HC-OA細(xì)胞凋亡的影響 與anti-miR-NC組相比，anti-miR-378c組HC-OA細(xì)胞凋亡率顯著降低，Bax蛋白的表達(dá)顯著降低，Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見圖3、圖4、表3。

圖2 抑制miR-378c表達(dá)對HC-OA細(xì)胞增殖蛋白表達(dá)的影響

表2 抑制miR-378c表達(dá)對HC-OA細(xì)胞增殖的影響

圖3 抑制miR-378c表達(dá)對HC-OA細(xì)胞凋亡率影響

圖4 抑制miR-378c表達(dá)對HC-OA細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響

表3 抑制miR-378c表達(dá)對HC-OA細(xì)胞凋亡的影響

2.4miR-378c靶向調(diào)控AKT1 miR-378c與WT-AKT1的3′UTR之間存在特異性結(jié)合位點見圖5。野生型AKT1基因熒光素酶表達(dá)載體WT-AKT1和miR-378c mimics共轉(zhuǎn)染HC-OA細(xì)胞后，miR-378c組HC-OA細(xì)胞熒光素酶活性較再轉(zhuǎn)染miR-NC組明顯降低(P<0.05)；而突變型AKT1基因熒光素酶表達(dá)載體MUT-AKT1和miR-378c mimics共轉(zhuǎn)染HC-OA細(xì)胞后，miR-378c組HC-OA細(xì)胞熒光素酶活性較再轉(zhuǎn)染miR-NC組差異不顯著(P>0.05)。見表4。與miR-NC組比較，miR-378c組HC-OA細(xì)胞p-AKT1 mRNA 和p-AKT1蛋白的表達(dá)量顯著減低；與anti-miR-NC組比較，anti-miR-378c組HC-OA細(xì)胞p-AKT1 mRNA和p-AKT1蛋白的表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。見圖6、表5。

圖5 AKT1的3′UTR含有miR-378c的互補序列

表4 雙熒光素酶報告實驗

1～4:miR-NC組、miR-378c組、anti-miR-NC組、anti-miR-378c組圖6 各組p-AKT1蛋白的表達(dá)

表5 miR-378c調(diào)控AKT1的表達(dá)

2.5干擾AKT1的表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制miR-378c表達(dá)對HC-OA細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用 與anti-miR-NC組比較，anti-miR-378c組HC-OA細(xì)胞在24 h、48 h、72 h時的細(xì)胞活力顯著升高，p-AKT1和CyclinD1蛋白的表達(dá)顯著升高，P21蛋白的表達(dá)顯著減低；與anti-miR-378c+si-NC組比較，anti-miR-378c+si-AKT1組HC-OA細(xì)胞在24 h、48 h、72 h時的細(xì)胞活力顯著降低，p-AKT1和CyclinD1蛋白的表達(dá)顯著降低，P21蛋白的表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見圖7、表6。

1～4：anti-miR-NC組、anti-miR-378c組、anti-miR-378c+si-NC組、anti-miR-378c+si-AKT1組；下圖同圖7 p-AKT1及增殖蛋白的表達(dá)

表6 干擾AKT1的表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制miR-378c表達(dá)對HC-OA細(xì)胞增殖的作用

2.6干擾AKT1的表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制miR-378c表達(dá)對HC-OA細(xì)胞凋亡的抑制作用 與anti-miR-NC組比較，anti-miR-378c組HC-OA細(xì)胞的凋亡率顯著降低，Bax蛋白的表達(dá)顯著降低，Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著升高；與anti-miR-378c+si-NC組比較，anti-miR-378c+si-AKT1組HC-OA細(xì)胞的凋亡率顯著升高，Bax蛋白的表達(dá)顯著升高，Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著降低。見圖8、表7。

圖8 凋亡蛋白的表達(dá)

表7 干擾AKT1的表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制miR-378c表達(dá)對HC-OA細(xì)胞凋亡的抑制作用

3 討 論

AKT激酶家族包括AKT1、AKT2和AKT3 3個成員，與磷脂酰肌醇3激酶(P13K)共同組成P13K/AKT信號通路。AKT1是P13K/AKT通路的重要組成部分，在3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶(PDK)1的輔助下，P13K通過使Akt蛋白上的磷酸化位點Thr308和Ser473磷酸化而使其激活，活化的AKT通過上調(diào)CyclinD1，磷酸化P21和P27等細(xì)胞周期蛋白，從而通過多種途徑促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡〔7，8〕。有研究發(fā)現(xiàn)〔9〕，抑制P13K/AKT通路可促進(jìn)OA大鼠模型中軟骨細(xì)胞的凋亡和自噬。miRNA是一類長度約為22 nt的單鏈RNA，其通過抑制翻譯或降解靶基因在細(xì)胞生長、分化、增殖和凋亡等多種調(diào)控通路中發(fā)揮作用。近年來，已發(fā)現(xiàn)多種miRNA參與OA軟骨細(xì)胞的增殖和凋亡〔10～12〕。例如，miR-543在OA模型大鼠軟骨組織中呈低表達(dá)，過表達(dá)miR-543體外可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖〔10〕；miR-127-5p在OA軟骨細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)miR-127-5p可促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖〔11〕。然而，miR-30a-5p在OA患者軟骨細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，且miR-30a-5p可通過靶向下調(diào)AKT，引起軟骨細(xì)胞周期阻滯，進(jìn)而誘導(dǎo)OA患者軟骨細(xì)胞的凋亡〔12〕。miR-378作為一種癌基因或抑癌基因，其在宮頸癌〔13〕、肝癌〔14〕和前列腺癌〔15〕等多種惡性腫瘤中的作用已被廣泛報道。已有的研究〔6〕發(fā)現(xiàn)，miR-378c在骨關(guān)節(jié)軟骨組織中表達(dá)上調(diào)，但miR-378c對OA軟骨細(xì)胞的增殖和凋亡的影響及miR-378c能否介導(dǎo)AKT1表達(dá)調(diào)控OA軟骨細(xì)胞的增殖和凋亡尚不清楚。

本研究首先對正常軟骨組織和OA軟骨組織中miR-378c和p-AKT1的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)miR-378c在OA軟骨組織中明顯上調(diào)，p-AKT1表達(dá)顯著下調(diào)，提示miR-378c和p-AKT1在軟骨細(xì)胞中的正常表達(dá)對維持軟骨細(xì)胞的正常功能具有重要的意義。隨后通過構(gòu)建抑制miR-378c表達(dá)HC-OA細(xì)胞株發(fā)現(xiàn)，HC-OA細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)，凋亡率顯著降低，CyclinD1和Bcl-2蛋白表達(dá)顯著增加，P21和Bax蛋白表達(dá)顯著降低。CyclinD1通過與細(xì)胞周期蛋白激酶(CDKs)結(jié)合，形成CyclinD1/CDKs復(fù)合物，促使成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白(pRb)的形成，進(jìn)而通過一系列核內(nèi)過程促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期〔16〕。P21則抑制CyclinD1/CDKs復(fù)合物的形成發(fā)揮相反的作用〔17〕。當(dāng)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)較高時，促凋亡蛋白Bax通過與Bcl-2結(jié)合形成異源二聚體Bax/Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡〔18,19〕。抑制miR-378c表達(dá)可能通過抑制P21和Bax表達(dá)，促進(jìn)CyclinD1和Bcl-2從而促進(jìn)HC-OA細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。雙熒光素酶報告基因檢測實驗顯示，AKT1是miR-378c的靶基因；Western印跡檢測顯示，miR-378c可負(fù)性調(diào)控AKT1的表達(dá)。為了進(jìn)一步驗證miR-378c是通過下調(diào)AKT1來調(diào)控HC-OA細(xì)胞的增殖和凋亡，隨后把anti-miR-378c和si-AKT1共轉(zhuǎn)染HC-OA細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，干擾AKT1的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)抑制miR-378c表達(dá)對HC-OA細(xì)胞增殖促進(jìn)和凋亡抑制作用。提示，miR-378c可通過下調(diào)AKT1表達(dá)，抑制OA軟骨細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

綜上，miR-378c在人OA軟骨組織中高表達(dá)，AKT1呈低表達(dá)，且miR-378c可能通過靶向下調(diào)AKT1抑制OA軟骨細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。這為研究OA的發(fā)病機(jī)制和臨床治療指明了新的發(fā)向。