甘草酸對(duì)銀屑病模型小鼠的作用研究

白美蓉 ，孫吉 ，付麗新 ，王文菊 ，陳濤

（1.成都市第二人民醫(yī)院，四川 成都 610017；2.四川醫(yī)療器械生物材料和制品檢驗(yàn)中心，四川 成都610000）

銀屑病是一種慢性炎癥性皮膚病，是多基因遺傳背景的由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病，目前尚無(wú)根治方法。甘草酸是豆科植物甘草的主要藥理活性成分，有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫及抗病毒等作用。目前在東亞地區(qū)，甘草酸制劑被作為一種安全有效的抗炎、免疫調(diào)節(jié)劑，廣泛用于多種炎性及自身免疫性皮膚疾病，如尋常型銀屑病、特應(yīng)性皮炎、白癜風(fēng)、斑禿、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、過(guò)敏性紫癜等的治療并受到廣泛關(guān)注[1-5]。甘草酸藥理作用靶點(diǎn)及分子機(jī)制尚不完全清楚。本研究以角蛋白14-血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（K14-VEGF）轉(zhuǎn)基因小鼠作為銀屑病動(dòng)物模型，探討甘草酸對(duì)該銀屑病模型小鼠的治療作用及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 復(fù)方甘草酸注射液購(gòu)于Nippon Kayaku公司；CD11c免疫組化抗體、過(guò)氧化物酶（MPO）免疫組化抗體購(gòu)于博奧森公司；CD3抗體購(gòu)于Abcam公司；SYBR熒光染料、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）試劑盒購(gòu)于Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與藥物處理 K14-VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠由四川大學(xué)生物治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。將20只發(fā)病程度中至重度的12周齡K14-VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為2組，每組10只，即模型對(duì)照組和甘草酸治療組。治療組小鼠腹腔注射復(fù)方甘草酸注射液（20 mg/kg），1 次/d，連續(xù) 7 d；對(duì)照組小鼠腹腔注射等體積磷酸鹽緩沖液（PBS）溶液。

1.2.2 皮損嚴(yán)重程度評(píng)分 基于銀屑病皮損面積及嚴(yán)重度指數(shù)（PASI）評(píng)分的改良評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)4項(xiàng)（皮損面積、紅斑、鱗屑大小及數(shù)量）對(duì)治療前后的所有小鼠耳部皮損進(jìn)行綜合評(píng)分（0=無(wú)，1=輕度，2=中度，3=重度），最終評(píng)分為4項(xiàng)總和（0～12分）。

1.2.3 組織學(xué)染色 甘草酸治療7 d后，各組小鼠頸椎脫臼處死，并取各組小鼠耳部組織固定于4%多聚甲醛溶液中，制備石蠟切片。首先進(jìn)行HE染色，觀察各組小鼠耳部組織病理學(xué)表現(xiàn)，測(cè)量表皮厚度并進(jìn)行Baker評(píng)分。然后進(jìn)行免疫組化染色（MPO、CD11c和CD3），并用光學(xué)顯微鏡200倍下觀察各組組織中中性粒細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

1.2.4 RT-PCR 甘草酸治療7 d后，取各組小鼠耳部組織凍于液氮中，并取0.1 g耳部組織研磨成粉末后，提取組織RNA。反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行RTPCR反應(yīng)。在25 μL RT-PCR反應(yīng)體系中分別加入 12.5 μL SYBR Green qPCR Master Mix，9 μL 滅菌的ddH2O，1 μL cDNA和2.5 μL對(duì)應(yīng)的引物。引物白細(xì)胞介素（IL）-6（Catalog：MQP036632）、IL-17（Catalog：MQP029457）、腫瘤壞死因子（TNF）-α（Catalog：MQP031019）和干擾素（IFN）-γ（Catalog：MQP027401）均是由 GeneCopoeia公司設(shè)計(jì)，經(jīng)qPCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證并優(yōu)化的引物。以GAPDH作為內(nèi)參基因。本實(shí)驗(yàn)反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃3 min，變性95 ℃ 15 s，退火 58℃ 30 s，延伸 72 ℃ 30 s，共 40 個(gè)循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，2組比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 甘草酸可顯著改善K14-VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠的銀屑病樣皮損表現(xiàn) 甘草酸治療7 d后，肉眼觀察發(fā)現(xiàn)治療組小鼠皮損面積、紅斑、鱗屑大小及數(shù)量等銀屑病樣皮膚損傷均顯著減輕；而對(duì)照組小鼠銀屑病樣皮損持續(xù)加重，見(jiàn)圖1A。同時(shí)通過(guò)改良后的PASI評(píng)分發(fā)現(xiàn)，甘草酸治療后的小鼠皮損評(píng)分（6.33±1.29）顯著低于對(duì)照組（11.33±1.37，P＜0.05），見(jiàn)圖1B。

圖1 甘草酸可有效治療K14-VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠的銀屑病樣皮損改變。（**P<0.01）

2.2 甘草酸可顯著減輕K14-VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠皮損的銀屑病樣病理組織學(xué)改變 光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠耳部皮損組織處組織學(xué)變化情況，如圖2A所示，對(duì)照組小鼠可見(jiàn)顯著的表皮組織增厚，棘突增長(zhǎng)，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和顯著的血管增生；而治療組表皮增殖、血管擴(kuò)張及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等銀屑病樣病理改變均得到顯著抑制。與對(duì)照組小鼠表皮厚度（67.08±8.168）μm相比，治療組小鼠表皮厚度（37.38±7.303）μm顯著減小，見(jiàn)圖2B；同時(shí)治療組小鼠Baker評(píng)分（3.400±0.788）也顯著低于對(duì)照組（6.950±0.797），見(jiàn)圖 2C。

圖2 2組小鼠耳部組織學(xué)改變情況。

2.3 甘草酸可顯著減少K14-VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠皮損中炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)情況 如圖3所示，光學(xué)顯微鏡下觀察2組小鼠免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，治療組小鼠皮損處T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均顯著降低，見(jiàn)圖3。

圖3 CD3、MPO 和 CD11c免疫組化染色（×200）。

2.4 甘草酸可顯著降低K14-VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠皮損中相關(guān)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)情況 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，治療組小鼠皮損處相關(guān)炎性細(xì)胞因子IL-17、IL-6和IFN-γ的表達(dá)均顯著降低（P<0.05），見(jiàn)圖4。

圖4 各組小鼠耳部皮損處IL-17，IFN-γ和IL-6 mRNA表達(dá)情況。（**P<0.01）

3 討論

甘草酸作為豆科植物甘草的主要藥理活性成分，有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫及抗病毒等作用。近來(lái)，在結(jié)腸炎[6]、腸缺血再灌注損傷[7]、急性肺損傷[8]及過(guò)敏性鼻炎[9]等動(dòng)物模型的研究中均顯示甘草酸具有良好的抗炎作用。而且，體外研究表明，甘草酸能抑制TNF-α誘導(dǎo)的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的細(xì)胞間黏附分子（ICAM-1）表達(dá)，抑制核因子（NF）-κB及絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）中 c-Jun氨基末端激酶（JNK）的活化[10]。隨著對(duì)其藥理作用的認(rèn)識(shí)，一系列含甘草酸或甘草次酸的制劑（如：復(fù)方甘草酸苷等）在諸多炎癥性皮膚疾?。ㄈ纾恒y屑病、特應(yīng)性皮炎等）中的應(yīng)用受到了越來(lái)越多的關(guān)注[11-12]。然而其具體藥理作用機(jī)制，目前仍不清楚。其臨床使用亦不為歐美等國(guó)主流皮膚科醫(yī)生理解與接受。本研究首先研究甘草酸對(duì)K14-VEGF銀屑病模型小鼠的治療效果。筆者發(fā)現(xiàn)甘草酸能明顯抑制K14-VEGF小鼠銀屑病樣皮損及組織學(xué)表現(xiàn)，抑制表皮增殖及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

目前，大量研究發(fā)現(xiàn)Th1/Th17細(xì)胞在銀屑病的發(fā)病機(jī)制中扮演了重要的作用[13-15]。在銀屑病的發(fā)病機(jī)制中，淋巴細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等為主要的浸潤(rùn)細(xì)胞。炎性細(xì)胞可在皮損處大量聚集。在本研究中也發(fā)現(xiàn)K14-VEGF銀屑病模型小鼠皮損處有大量的炎性細(xì)胞（T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞）浸潤(rùn)，而甘草酸可顯著抑制上述炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)情況。研究發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞在銀屑病樣皮損處可分泌多種炎性細(xì)胞因子，如IFN-γ，IL-6，IL-1 β，IL-8，IL-17，TNF- α 等，從而進(jìn)一步誘導(dǎo)疾病的發(fā)展[16]。在本研究中發(fā)現(xiàn)甘草酸也可以抑制銀屑病樣皮損處相關(guān)炎性細(xì)胞因子IL-17、IL-6和IFN-γ的表達(dá)，從而有效改善銀屑病樣皮損改變，起到治療銀屑病的作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)甘草酸可有效治療K14-VEGF銀屑病模型小鼠的銀屑病樣改變，其治療作用是通過(guò)抑制炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和相關(guān)炎性細(xì)胞因子IL-17、IL-6和IFN-γ的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。該研究為臨床使用甘草酸治療銀屑病等相關(guān)炎癥性疾病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。