調(diào)控JAKS/STATS通路探討健脾祛濕法治療尋常型銀屑病的機制

劉朝霞，魏建華，姚尚萍，豐靚，劉紅霞

（新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊830000）

銀屑病是一種由多基因遺傳決定的、多環(huán)境因素刺激，免疫介導的，以角質(zhì)形成細胞增生過度、分化不全、大量炎性細胞浸潤和新生血管形成為主的慢性炎癥性組織病理改變的皮膚類疾病[1-2]。Janus激酶-信號轉(zhuǎn)導子與轉(zhuǎn)錄激活子信號通路（JAK/STAT）作為機體內(nèi)普遍存在的經(jīng)典信號通路，在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，主要通過多種細胞因子調(diào)控，介導參與機體內(nèi)免疫細胞分化、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、介導炎性反應(yīng)、刺激細胞凋亡和增殖等過程[3]。

健脾解毒湯是岐黃學者，全國名老中醫(yī)藥專家劉紅霞教授結(jié)合新疆的地域特征治療銀屑病的經(jīng)驗方，經(jīng)多年臨床觀察，療效確切，劉紅霞教授認為新疆年降水量少，氣候干燥，燥邪傷津耗氣，津傷則津液陰血不足，津液、陰血均為氣所化生，亦為氣之物質(zhì)基礎(chǔ)，脾為后天之本，為氣血津液生化之源，故燥邪易傷及脾胃；新疆冬季漫長，飲食以肉食為主，易生濕化熱，傷及脾胃，提出“健脾祛濕法”治療銀屑病的學術(shù)思想，自擬健脾解毒湯運用臨床療效滿意。為進一步驗證健脾解毒湯治療尋常型銀屑病的作用機制，本次實驗，通過健脾解毒湯全方及不同拆方干預脾虛濕盛型尋常型銀屑病小鼠，檢測JAK/STAT信號通路中，轉(zhuǎn)錄因子（STAT）3，磷酸化轉(zhuǎn)錄因子（p-STAT）3，STAT5，p-STAT5 在脾虛濕盛型銀屑病小鼠組織中的表達，評估健脾解毒湯及拆方對尋常型銀屑病治療的貢獻大小，進一步闡釋健脾祛濕法治療銀屑病的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 實驗動物美國癌癥研究所（ICR）小鼠 70 只，4～6 周齡；體質(zhì)量 18～25 g，平均 20.4 g；由新疆醫(yī)科大學動物實驗中心提供（動物批號：XJDC-1811）。TIANScript RT Kit購自中國天根公司；SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）購自中國天根公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自中國Solarbio公司；Anti-STAT3抗體（ab68153）購自美國Abcam公司；Anti-p-STAT3抗體（9145）購自美國CST公司；Anti-STAT5抗體（ab32043）購自美國Abcam公司；Anti-p-STAT5抗體（ab32364）購自美國 Abcam公司；Pierce Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）購自美國Pierce公司。

1.2 方法

1.2.1 動物建模制備和分組給藥

1.2.1.1 動物分組 動物均適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。隨機分為7組，每組10只：空白對照組（A組）、阿維A膠囊組（B組）、健脾湯組（C組）、解毒湯組（D組）、健脾解毒湯組（E組）、脾虛模型組（F組）、脾虛+銀屑病組（G組）。

1.2.1.2 脾虛濕盛動物模型 將生大黃以10倍體積的純凈水浸泡過夜，大火煮沸后轉(zhuǎn)文火并保持15 min。倒出藥汁，再以8倍體積水重復1次，合并濾液，濃縮至100%。置于4℃冰箱冷藏備用。

對B組、C組、D組、E組、F組、G組中的每只小鼠用大黃水煎液灌服，0.6 mL/只，共7 d。

1.2.1.3 脾虛濕盛型銀屑病動物模型 將B組、C組、D組、E組、G組中的小鼠背部剃毛，面積為3 cm×5 cm，局部外用5%咪喹莫特乳膏50.0 mg/d，均勻涂抹于小鼠背部無毛區(qū)域，厚度約為1～2 mm，充分涂抹以使藥物盡可能被皮膚吸收，單指輕壓按摩約60次，1 次/d，連續(xù)用藥 8 d。

1.2.1.4 健脾解毒湯及拆方給藥 A組、F組和G組0.2 mL蒸餾水灌胃，1次/d；B組用藥量為0.03 g/L，1次/d，定時灌胃1 mL，D組、C組和E組用藥量為1.67 mL/（kg·d），連續(xù)用藥28 d。

1.2.2 皮損組織病理學檢查 相應(yīng)皮損組織用固定液固定組織標本，常規(guī)石蠟包埋、切片，HE染色后在光鏡下觀察組織病理變化。

1.2.3 RT-qPCR 通過DNAMAN軟件設(shè)計STAT3、STAT5、GAPDH熒光實時定量PCR引物，并由上海生工有限公司合成。分別加入2 μL 5×PrimeScript Buffer，0.5 μL PrimeScript RT Enzyme Mix I，0.5 μL Oligo（dT）15（15μM），0.5 μL Random 6 mers（100 μM），Total RNA 500 ng，RNase Free dH2O達到10 μL，混勻后短暫離心，在PCR儀上37℃溫浴 15 min，85 ℃加熱 5 s，稀釋至 35 μL，得到反轉(zhuǎn)錄的 cDNA。 qPCR 反應(yīng)：Forward Primer 10 μM 0.8 μL，0.8 μL Reverse Primer 10 μM，2XSYBR Select Master Mix （2×）10 μL，RNase-free water 6.4 μL，cDNA template 2 μL，配制成20 μL體系混合均勻，在儀器上保持 95℃，1 min，95℃，10 s，60℃ 34 s，40個循環(huán)，94℃ 1 min 30 s，60℃ 1 min，60℃→94℃，1.1℃/s升溫，從而獲得qPCR反應(yīng)結(jié)果。

1.2.4 免疫印跡法（Western blot） 將少量皮損組織塊置于1～2 mL勻漿器中球狀部位，加400 μL單去污劑裂解液（含PMSF）于勻漿器中進行勻漿，重復碾幾次使組織盡量碾碎，裂解30 min后，在4℃下12 000轉(zhuǎn)/min離心5 min，取適當稀釋的上清液用BCA法來測定蛋白濃度，調(diào)整蛋白質(zhì)濃度后采用 Western blot檢測組織內(nèi) STAT3、STAT5、p-STAT3、p-STAT5的表達，其步驟大致如下；經(jīng)過灌膠、加樣、電泳、轉(zhuǎn)膜后，將膜裝入5%牛血清白蛋白（BSA）封閉液，制置室溫搖床1 h，加5 mL一抗稀釋液于4℃冰箱過夜。然后加10 mL二抗稀釋液（1∶10 000）置于搖床上 1 h，顯色，在暗室中壓片曝光顯影，結(jié)果用Quantity-one圖像軟件分析并進行光密度值掃描，分別計算目的蛋白條帶與GAPDH強度比值（%）。

2 結(jié)果

2.1 皮損組織病理變化 皮損組織蘇木精-伊紅染色實驗結(jié)果，見圖2A～G。在100×倍鏡下觀察，各組小鼠皮損組織形態(tài)：A組小鼠表皮層相對較薄，真皮層較為緊密。F組與其相比，炎性細胞浸潤，表皮無明顯增生現(xiàn)象，表皮較正常組變薄，脾虛濕盛型銀屑病模型，表皮增生明顯，伴有Munro微膿腫，內(nèi)有炎性細胞及表皮細胞碎片，角化不全嚴重，形成銀屑病樣皮損。B組、C組、D組和E組有不同程度的緩解，其中E組優(yōu)于其他各治療組。

2.2 STAT3和STAT5 mRNA表達差異型 對A、B、C、D、E、F、G 各組的皮損組織進行 STAT3 和STAT5的實時熒光定量實驗，進行其mRNA表達差異型分析，見表1、圖2。STAT3和STAT5的mRNA表達結(jié)果顯示，A組與其他各組之間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；F組、G組與其他各組之間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；E組與D組、C組之間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；E組與B組之間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

圖1 小鼠皮損組織的病理圖（蘇木精-伊紅染色×100）

表1 各組皮損組織中STAT3、STAT5的mRNA表達情況

圖2 各組組織中STAT3、STAT5 mRNA的表達情況

2.3 STAT3、STAT5、p-STAT3、p-STAT5 在皮損組織中蛋白表達差異型 對A、B、C、D、E、F、G各組的皮損組織進行STAT3、STAT5、p-STAT3和p-STAT5的Western blot實驗，進行蛋白表達差異型分析，見表2、圖3A～D。STAT3和STAT5的蛋白表達結(jié)果顯示，各組之間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。p-STAT3和p-STAT5蛋白表達結(jié)果顯示，A組與其他各組之間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；F組、G組與其他各組之間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；E組與D組、C組之間差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；E組與B組之間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

表2 各組皮損組織中STAT3、STAT5、p-STAT3、p-STAT5的蛋白表達情況

圖3 各組組織中STAT3、STAT5、p-STAT3、p-STAT5蛋白的表達情況

3 討論

銀屑病是一種有遺傳背景、與免疫反應(yīng)異常有關(guān)的、臨床常見的慢性炎癥性皮膚病，全球發(fā)病率約為1%～3%[2，4]。目前研究表明，銀屑病和多個基因遺傳密切相關(guān)，皮損部位內(nèi)異常T淋巴細胞浸潤為銀屑病發(fā)生的重要因素，T細胞的異常活化會主動或被動的分泌多種細胞因子，這些細胞因子可以通過 JAKs/STATs、MAPK、NF-κb 等多條信號通路，參與到銀屑病發(fā)病過程中，但JAK/STAT信號通路是機體內(nèi)非常重要的一條由細胞因子刺激的信號轉(zhuǎn)導通路，大多數(shù)細胞因子主要通過JAK/STAT信號通路發(fā)揮其生物學功能[5]。在銀屑病發(fā)病過程中，JAK/STAT信號通路參與皮損表皮基層角質(zhì)細胞的異常分化、血管異常增生、過度角化等多種病理過程，因此JAK/STAT信號通路在銀屑病的免疫反應(yīng)和炎性反應(yīng)及細胞信號傳遞中發(fā)揮重要作用[6]。

JAK/STAT信號通路是繼Ras信號通路后，近年來發(fā)現(xiàn)的一條新型的信號通路，其信號通路較為簡單，但可在不同細胞因子的刺激下，將信號轉(zhuǎn)導通路和細胞增殖、分化、侵襲、凋亡及免疫調(diào)控等多種重要的生物功能相聯(lián)系[3，7]。而JAK/STAT信號通路的缺陷或異常活化都可與銀屑病的發(fā)生發(fā)展及預后有著密不可分的關(guān)系。Jak是一類胞質(zhì)內(nèi)非受體型可溶型酪氨酸蛋白激酶，目前發(fā)現(xiàn)有4個成員：Jak1、Jak2、Jak3和Tyk2。STAT包含7個家族成員：STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6。本次實驗重點關(guān)注STAT3和STAT5。STAT3和STAT5均屬于JAK2的底物，結(jié)合活化后可使STAT3和STAT5磷酸化，并迅速形成同源或異源二聚體，轉(zhuǎn)運至細胞核內(nèi)，與相關(guān)的啟動子結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄，實現(xiàn)細胞因子受體介導的信號傳導，發(fā)揮信號調(diào)控作用，進而起到機體免疫調(diào)控作用和獲得型免疫應(yīng)答反應(yīng)[8-9]。

銀屑病屬中醫(yī)“白疕’、“松皮癬”、“干癬”等范疇。中醫(yī)藥在治療銀屑病上積累了豐富的臨床經(jīng)驗，大量研究證明中醫(yī)藥有確切療效，尤其在控制復發(fā)及藥物安全型上優(yōu)勢明顯。本次實驗通過“健脾祛濕法”干預小鼠動物模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脾虛濕盛型銀屑病皮損組織的病理表征明顯，在藥物干預后，有明顯治愈現(xiàn)象，健脾解毒湯相對其他方法效果更為優(yōu)異。脾虛濕盛型銀屑病中STAT3和STAT5在mRNA水平上，表達異常升高；健脾解毒湯及拆方干預后，可有效降低STAT3和STAT5的mRNA表達量，健脾解毒湯作用最為明顯。在蛋白表達方面，p-STAT3和p-STAT5蛋白表達量在脾虛濕盛型銀屑病中表達量異常升高，健脾解毒湯及拆方干預后，有效的降低了其表達量，其中健脾解毒湯作用也是最為明顯。說明健脾解毒湯可抑制STAT3和STAT5在mRNA水平上的表達、抑制STAT3和STAT5的磷酸化，通過抑制STAT3和STAT5的表達和磷酸化，可使細胞因子傳導中斷或干擾，阻止銀屑病角質(zhì)形成細胞的過度增殖分化和炎性反應(yīng)侵潤，促進皮損的消退，發(fā)揮治療銀屑病的作用。