倒置顯微鏡拍照法對浮游植物計數(shù)的穩(wěn)定性分析

陳明華，史康佳，李志杰，蔡 菲，張 浩，張建輝，胡文濤

(1：南昌大學(xué)鄱陽湖環(huán)境與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌330031)(2：南昌大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，南昌330031)(3：南昌大學(xué)資源環(huán)境與化工學(xué)院，南昌330031)

浮游植物是水生生態(tài)系統(tǒng)中重要的初級生產(chǎn)者[1-2]，準(zhǔn)確地分析浮游植物種群和群落數(shù)量是河流、湖泊生態(tài)健康評價和生態(tài)功能分析的基礎(chǔ). 浮游植物定量分析方法現(xiàn)有鏡檢法、光密度法、流式攝像機(jī)計數(shù)法、流式細(xì)胞儀法、葉綠素a法等[3]，其中鏡檢法又分為計數(shù)框行格法、目鏡視野法、目鏡行格法、倒置顯微鏡視野法，選擇不同鏡檢方法對生物量計算有影響. 浮游植物生物量計算方法有標(biāo)準(zhǔn)法、細(xì)分法、粗分法和資料法[1]，以上方法都是基于浮游植物細(xì)胞生物量體積法[4-5]. 影響浮游植物定量分析的因素有采樣、濃縮和鏡檢等，其中浮游植物鏡檢尤其突出，顯微鏡鏡檢法作為浮游植物計數(shù)最經(jīng)典方法，是檢驗(yàn)其他方法是否有效的依據(jù)[2]，是衡量浮游植物計數(shù)是否準(zhǔn)確的標(biāo)準(zhǔn)，在河流湖泊生態(tài)學(xué)研究中具有不可替代的作用.

顯微鏡鏡檢法不僅可以測定浮游植物生物量，還可以進(jìn)行浮游植物的種類及群落結(jié)構(gòu)分析[6]，顯微鏡鏡檢法不僅能較為全面地反映樣品的種類分布情況，而且準(zhǔn)確度高、變異系數(shù)小，目前仍為國際上浮游植物調(diào)查研究最通用的方法[1-2,6-8]，通常采用的顯微鏡鏡檢法有計數(shù)框正置鏡檢法和Uterm?hl管倒置鏡檢法[4-5,9-17]. 鏡檢法以外的方法在定量分析過程中很難解釋浮游植物群落結(jié)構(gòu)的變化及演替，例如流式細(xì)胞技術(shù)提供了一種簡單、快速分析浮游生物的實(shí)驗(yàn)方法[4]，但存在較大誤差，無法準(zhǔn)確評價浮游植物在湖泊河流生態(tài)系統(tǒng)中的作用. 鏡檢法通常依靠人的眼睛觀察但存在問題：對浮游植物計數(shù)和體積測量因顯微鏡和研究人員不同而結(jié)果不同，尤其是鏡檢次數(shù)對計數(shù)影響如何？一個樣品重復(fù)鏡檢多少次符合實(shí)際情況？不同門類浮游植物鏡檢次數(shù)是否要一樣？不同倍數(shù)下鏡檢次數(shù)對計數(shù)影響如何？微囊藻與硅藻的計數(shù)次數(shù)是否應(yīng)該一樣？同一鏡檢條件下不同藻類如何鏡檢？這些實(shí)際問題直接影響浮游植物定量分析. 浮游植物生態(tài)學(xué)研究雖然已經(jīng)積累了豐富的數(shù)據(jù)，但以上實(shí)際計數(shù)方法上的差異性導(dǎo)致研究結(jié)果較難與國際接軌. 現(xiàn)隨著顯微拍攝技術(shù)的發(fā)展，本研究提出倒置顯微鏡拍照法，減少人為因素導(dǎo)致的鏡檢誤差，對拍照法的影響進(jìn)行分析，進(jìn)一步完善浮游植物計數(shù)的定量化研究，為藻類生態(tài)學(xué)研究提供科學(xué)方法.

1 材料與方法

1.1 樣品采集

實(shí)驗(yàn)選用的浮游植物樣品分為純藻樣品和野外樣品，純藻樣品為實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的四尾柵藻、斜生柵藻、小球藻3種純藻，野外樣品為鄱陽湖出湖口、主湖區(qū)和湖汊3種生境浮游植物樣品. 野外浮游植物樣品在水面與0.5 m深的水層之間使用柱狀采水器采集，用網(wǎng)目孔徑為4 μm的浮游植物網(wǎng)過濾5 L水樣，并將浮游植物樣品加1滴魯格氏液保存在50 mL的樣品瓶中，樣品使用冷藏箱保存等待鏡檢. 野外樣品須在水體透明度大于30 cm的水體采集，若透明度小于30 cm時，須將混后水樣在10 L水桶中待泥沙沉降后再取混合水樣，以避免泥沙對浮游植物鏡檢的影響.

1.2 樣品鏡檢

計數(shù)框行格法采用長20 mm、寬20 mm、體積0.1 mL的計數(shù)框?qū)Ω∮沃参镞M(jìn)行鏡檢，樣品厚度約為250 μm，計數(shù)框橫、豎各劃分10行格，共100個小方格. 將計數(shù)樣品充分搖勻，吸取0.1 mL到計數(shù)框中，對計數(shù)框上第2、5、8行共30個小方格(面積為120 mm2)進(jìn)行計數(shù)[18]，在5、10、20和40倍下分別需觀察15、30、97和392個視野數(shù).

倒置顯微鏡拍照法采用直徑27.5 mm、面積593.6 mm2、體積5 mL的管狀浮游浮游植物計數(shù)管對浮游植物進(jìn)行鏡檢. 取0.5 mL樣品置于計數(shù)管內(nèi)，樣品厚度約為842 μm，靜置30 min，通過顯微鏡攝像頭對浮游植物拍照. 倒置顯微鏡拍照法不需長時間沉淀和次級抽樣步驟而直接計數(shù)，在5、10、20和40倍下對樣品分別拍攝5、10、20和20張浮游植物照片，且40倍條件下至少拍攝每個樣品中所含有種類數(shù)的照片量，即有多少種就需拍攝多少張照片，照片應(yīng)均勻分布在計數(shù)管內(nèi).

1.3 計數(shù)公式

計數(shù)框行格法計數(shù)公式為：

(1)

式中，N為每升原水樣中的浮游植物數(shù)量(個/L)，Sk為計數(shù)框面積(mm2)，Sj為計數(shù)面積(mm2)，Vs為濃縮后水樣的體積(mL)，Va為取樣鏡檢水樣體積(計數(shù)框體積)(0.1 mL)，n為計數(shù)所得浮游植物的數(shù)量，Vm為野外水樣體積(mL).

倒置顯微鏡拍照法計數(shù)公式為：

N=∑Ni

(2)

(3)

式中，Ni為第i物種在1 L水樣中的個體數(shù)量，Sg為計數(shù)管面積(mm2)，Sj為計數(shù)照片面積(mm2)，P為照片數(shù).

2 結(jié)果與分析

2.1 計數(shù)框行格法計數(shù)

采用計數(shù)框行格法對純藻樣品和野外樣品進(jìn)行觀察，樣品在5倍下觀察形狀為兩方格(圖1)，浮游植物個體太小，個數(shù)太多，無法計數(shù)；樣品在10倍下觀察形狀為一個小方格(有少部分不在視野中)，個體太小，個數(shù)太多，無法計數(shù)；樣品在20倍下觀察計數(shù)形狀為圓形，小球藻個體偏小，個數(shù)太多，四尾柵藻、斜生柵藻個體清晰可見，計數(shù)準(zhǔn)確，野外樣品個體清晰可見，計數(shù)準(zhǔn)確，但有些種類識別不出；樣品在40倍下觀察計數(shù)形狀為圓形，純藻樣品和野外樣品浮游植物清晰可見且計數(shù)準(zhǔn)確.

小球藻在20倍下計數(shù)5個視野，平均每個視野浮游植物144個，在40倍下計數(shù)10個視野，平均每個視野浮游植物28個；四尾柵藻在20倍下計數(shù)5個視野，平均每個視野浮游植物74個，在40倍下計數(shù)10個視野，平均每個視野浮游植物13個；斜生柵藻在20倍下計數(shù)5個視野，平均每個視野浮游植物222個，在40倍下計數(shù)10個視野，平均每個視野浮游植物42個. 出湖口樣品在20倍下計數(shù)5個視野，平均每個視野浮游植物6個，在40倍下計數(shù)10個視野，平均每個視野浮游植物2個；主湖區(qū)樣品在20倍下計數(shù)5個視野，平均每個視野浮游植物18個，在40倍下計數(shù)10個視野，平均每個視野浮游植物10個；湖汊樣品在20倍下計數(shù)5個視野，平均每個視野浮游植物18個，在40倍下計數(shù)10個視野，平均每個視野浮游植物3個(表1).

2.2 倒置顯微鏡拍照法計數(shù)

采用倒置顯微鏡拍照法對純藻樣品和野外樣品進(jìn)行觀察，樣品在5、10、20、40倍下觀察計數(shù)形狀都為長方形即照片形狀(圖2)；樣品在5倍下觀察計數(shù)個體太小，個數(shù)太多，無法計數(shù)；樣品在10倍下觀察計數(shù)個體太小，個數(shù)太多，估算計數(shù)；樣品在20倍下觀察計數(shù)，小球藻個體偏小，個數(shù)較多，四尾柵藻、斜生柵藻、野外樣品個體清晰可見且計數(shù)準(zhǔn)確；樣品在40倍下觀察計數(shù)，小球藻、四尾柵藻、斜生柵藻和野外樣品藻體清晰可見且計數(shù)準(zhǔn)確.

小球藻在10倍下計數(shù)2張照片，平均每張照片浮游植物302個，在20倍下計數(shù)5張照片，平均每張照片浮游植物73個，在40倍下計數(shù)10張照片，平均每張照片浮游植物18個；四尾柵藻在10倍下計數(shù)2張照片，平均每個照片浮游植物102個，在20倍下計數(shù)5張照片，平均每張照片浮游植物27個，在40倍下計數(shù)10張照片，平均每張照片浮游植物7個；斜生柵藻在10倍下計數(shù)2張照片，平均每個照片浮游植物325個，在20倍下計數(shù)5張照片，平均每張照片浮游植物77個，在40倍下計數(shù)10張照片，平均每張照片浮游植物20個. 出湖口樣品在20倍下計數(shù)5個視野，平均每個視野浮游植物2個，在40倍下計數(shù)10個視野，平均每個視野浮游植物0.5個；主湖區(qū)樣品在20倍下計數(shù)5個視野，平均每個視野浮游植物10個，在40倍下計數(shù)10個視野，平均每個視野浮游植物2～3個；湖汊樣品在20倍下計數(shù)5個視野，平均每個視野浮游植物13個，在40倍下計數(shù)10個視野，平均每個視野浮游植物3～4個(表2).

2.3 兩種方法計數(shù)統(tǒng)計分析

采用計數(shù)框行格法和倒置顯微鏡拍照法對6種樣品進(jìn)行鏡檢計數(shù)數(shù)據(jù)分析. 結(jié)果表明，計數(shù)框行格法計數(shù)的變異系數(shù)都較大，變異系數(shù)最大的是四尾柵藻樣品(25.980)，變異系數(shù)最小的是出湖口樣品(9.157)；倒置顯微鏡拍照法計數(shù)的變異性都較小，變異系數(shù)最大的是出湖口樣品(6.356)，變異系數(shù)最小的是湖汊樣品(0.812)(表3). 與計數(shù)框行格法相比，倒置顯微鏡拍照法變異系數(shù)較小，說明倒置顯微鏡拍照法在浮游植物計數(shù)時穩(wěn)定，存在較少影響因素.

圖1 計數(shù)框行格法計數(shù)視野Fig.1 Counting field of view by counting box row grid method

圖2 倒置顯微鏡拍照法計數(shù)照片F(xiàn)ig.2 Counting photos with inverted microscope

表3 兩種鏡檢方法的變異系數(shù)

3 討論

3.1 影響浮游植物定量分析的因素

影響浮游植物定量分析的因素主要有采樣、鏡檢和浮游植物種類等. ① 因野外采樣方法不同常導(dǎo)致浮游植物定量分析不準(zhǔn)確，例如使用浮游植物網(wǎng)采樣會使微小浮游植物丟失；使用濃縮法在浮游植物樣品濃縮不同倍數(shù)時浮游植物損失各不相同，因?qū)嶋H操作時濃縮法存在很大的經(jīng)驗(yàn)性，從而降低了不同來源數(shù)據(jù)之間的可比性[2]；使用聯(lián)合國教科文組織1978年編入《浮游植物手冊》(Phytoplankton manual)[17]的Uterm?hl法可較好地避免浮游植物采樣影響，但在移除樣品上清液時會導(dǎo)致浮游植物損失，且Uterm?hl倒置計數(shù)管視野法最大的沉淀樣品量為100 mL. ② 浮游植物因鏡檢方法不同導(dǎo)致定量分析不準(zhǔn)確，比如：計數(shù)框行格法、目鏡視野法、目鏡行格法、Uterm?hl倒置計數(shù)管視野法等不同鏡檢方法在不同倍數(shù)條件下對定量分析的影響；因鏡檢使用不同容器及不同體積樣品(如計數(shù)框0.1 mL和計數(shù)管1 mL)對定量分析的影響；因使用正置顯微鏡和倒置顯微鏡等不同顯微鏡及鏡檢不同人對定量分析的影響. 因此鏡檢方法選擇是浮游植物定量分析的關(guān)鍵. ③ 浮游植物因種類不同而導(dǎo)致定量分析有差異. 不同門類植物的計數(shù)方式不同，例如盤星藻屬、微囊藻屬與裸藻屬等計數(shù)方式不同，常導(dǎo)致定量分析不準(zhǔn)確；不同浮游植物物種線性參數(shù)測量不同，浮游植物體積生物量計算模型構(gòu)建不同. ④ 浮游植物定量分析從野外采樣到數(shù)據(jù)分析，共經(jīng)歷3次重新抽樣：第1次是野外采樣調(diào)查；第2次是從樣品中取0.1～1 mL計數(shù)；第3次是從計數(shù)框或計數(shù)管中選擇觀察的視野面積. 3次重新抽樣分析和“采樣、鏡檢和種類參數(shù)”分析未形成操作標(biāo)準(zhǔn)程序，常導(dǎo)致浮游植物定量分析數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確，最終研究結(jié)論較難解釋實(shí)際現(xiàn)象和科學(xué)問題.

3.2 鏡檢方法的比較分析

鏡檢方法有正置鏡檢法和Uterm?hl倒置計數(shù)管視野法，其中正置鏡檢法又分為計數(shù)框行格法、目鏡視野法和目鏡行格法，以上4種鏡檢方法都是人工視野法，即研究人員通過眼睛在目鏡中觀察每個視野，記錄每個視野下有多少個浮游植物. 計數(shù)框行格法、目鏡視野法、目鏡行格法、Uterm?hl倒置計數(shù)管視野法和倒置顯微鏡拍照法這5種鏡檢方法的比較分析見表4，以上5種方法在5、10倍下因浮游植物個體太小、個數(shù)太多，無法計數(shù)；目鏡視野法、Uterm?hl倒置計數(shù)管視野法在20、40倍下觀察計數(shù)形狀都為圓形，即一個視野，20、40倍下視野直徑分別為1200、600 μm，面積分別為1.23、0.306 mm2，計數(shù)與計數(shù)框行格法結(jié)果一樣. 目鏡行格法在20、40倍下觀察計數(shù)形狀為寬度150或100 μm、長度2 mm的長方形，計數(shù)面積小于20、40倍下一個視野面積，故沒采用目鏡行格法計數(shù)方法.

本研究提出倒置顯微鏡拍照法可以減少以上4種方法缺陷，實(shí)現(xiàn)計數(shù)穩(wěn)定. 倒置顯微鏡拍照法是將顯微鏡下觀察到的浮游植物拍照保存，鏡檢過程僅需按程序拍照，然后對浮游植物照片進(jìn)行分析計數(shù)及種類識別，避免因鏡檢人專業(yè)水平等因素影響. 影響倒置顯微鏡拍照法定量分析主要因素是顯微鏡的攝像頭像素和拍照照片數(shù)量，樣品靜置沉降時間長短對定量分析有一定影響，由于浮游植物的沉降與藻體本身的形態(tài)、大小和生理狀態(tài)等都有密切的關(guān)系, 理論上沉降的時間越長越好,但實(shí)際工作往往都有時間的限制[13]，倒置顯微鏡拍照法沉淀浮游植物樣品為0.5 mL，樣品厚度842 μm，故此法沉降的時間在30 min即可消除沉降時間對鏡檢的影響.

表4 五種鏡檢方法的比較分析

3.3 鏡檢視野數(shù)和個體計數(shù)分析

鏡檢視野數(shù)和個體計數(shù)因浮游植物不同種類個體大小差異常導(dǎo)致定量分析不準(zhǔn)確. 目前鏡檢法計數(shù)方式為：① 計數(shù)100～500個視野，計數(shù)值至少在300個以上，先計數(shù)100個視野，如計數(shù)后數(shù)值太少，再增加100個視野，計數(shù)視野均勻分布在計算框上；② 牛海玉等[7]認(rèn)為鏡檢時選擇計數(shù)400個即可基本保證定量數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性；③ 王驥等[19]認(rèn)為視野在計數(shù)框中分布要滿足均勻性和隨機(jī)性，每次計數(shù)100個視野，每個樣品計數(shù)兩次取其平均值. 以上計數(shù)方法對浮游植物定量分析有較大不確定性，例如：計數(shù)值300個如何確定，盤星藻屬與裸藻屬計算個數(shù)方法不同；某些樣品中浮游植物個數(shù)沒有300個，又如何計數(shù)；“先計數(shù)100個視野”是在多少倍下計數(shù)沒確定，不同藻類需在不同倍數(shù)下才能分清種類；在40倍條件下100個視野僅占計數(shù)框的8.1%，計數(shù)100個視野所用時間通常100～200 min，工作量太大. 鏡檢法計數(shù)常因研究人員不同，導(dǎo)致 “藻類計數(shù)、視野次數(shù)”等結(jié)果出現(xiàn)偏差，因此顯微鏡人工鏡檢對專業(yè)水平要求高[3]. 以上4種鏡檢方法并未對浮游植物分類及計數(shù)留下可重復(fù)分析的證據(jù)，常導(dǎo)致浮游植物定量分析不可重復(fù)計數(shù).

3.4 倒置顯微鏡拍照法分析

倒置顯微鏡拍照法對四尾柵藻、斜生柵藻、小球藻和野外浮游植物樣品進(jìn)行拍照分析，拍照數(shù)量可依據(jù)浮游植物密度而增減，在20倍下鏡檢時，當(dāng)每張照片浮游植物個數(shù)少于5個時，拍攝照片數(shù)不少于20張；當(dāng)每張照片浮游植物個數(shù)為6～10個時，拍攝照片數(shù)不少于10張；當(dāng)每張照片浮游植物個數(shù)為11～15個時，拍攝照片數(shù)不少于5張；當(dāng)每張照片浮游植物個數(shù)大于15個時，需對水樣進(jìn)行稀釋再觀察，任何倍數(shù)下拍攝照片總面積不少于計數(shù)管面積的0.2%. 顯微鏡選擇倒置Leica DMI4000B顯微鏡，視野參數(shù)、照片參數(shù)、計數(shù)照片數(shù)見表5.

表5 倒置顯微鏡拍照法鏡檢參數(shù)

倒置顯微鏡拍照法計數(shù)依據(jù)照片上的浮游植物進(jìn)行計數(shù)，以保證計數(shù)結(jié)果的可比性和重復(fù)性. 在拍照過程中，常遇到某些個體一部分在照片中，另一部分在照片外，可規(guī)定出現(xiàn)在照片上都計數(shù)，因?yàn)槊繌堈掌伎蓡为?dú)拍照，相互之間獨(dú)立. 計數(shù)單位可以用個體或細(xì)胞表示，用個體數(shù)表示，計數(shù)時較省力，但由于藻類的個體有單細(xì)胞或由數(shù)目相差懸殊的多細(xì)胞組成的群體，因此用個體數(shù)表示不及用細(xì)胞數(shù)表示精確. 當(dāng)用細(xì)胞數(shù)表示時，對絲狀、群體種類，可先計算個體數(shù)，然后求出該種類的個體的平均細(xì)胞數(shù)進(jìn)行換算. 計數(shù)前先對樣品在5倍物鏡下作定性觀察，以熟悉主要種類及其形態(tài)特點(diǎn)；在10、20和40倍物鏡下分別拍攝10、20和20張，每個樣品應(yīng)取樣計數(shù)3次，通過增加拍照數(shù)可提高計數(shù)的穩(wěn)定性.

倒置顯微鏡拍照法影響因素主要有顯微鏡攝像頭和浮游植物種類對計數(shù)影響. 浮游植物不同種類因個體大小相差懸殊而影響鏡檢計數(shù)，主要影響在一張照片上包含藻類數(shù)量，例如小球藻、四尾柵藻屬可在一張40倍照片上，但顆粒直鏈藻則需在20倍下觀察，因此在多少倍物鏡條件下鏡檢要依據(jù)不同浮游植物種類來確定，避免對每種浮游植物測量線性參數(shù)和計數(shù)的影響. 采用浮游植物個體數(shù)量來估算浮游植物豐度可以說是不夠精確的，因?yàn)椴煌N的浮游植物細(xì)胞大小差別很大[6]，因此倒置顯微鏡拍照法才能準(zhǔn)確地對每種物種進(jìn)行計數(shù)分析，在進(jìn)行生物量計算前首先要確定不同種類浮游植物的細(xì)胞大小及其計數(shù)的個數(shù)，依據(jù)種的計數(shù)才能計算出屬、門等個數(shù).

4 結(jié)論

1)倒置顯微鏡拍照法是浮游植物鏡檢的最佳方法. 在20倍下拍攝20張照片，對20張照片進(jìn)行照片圖像分析，避免傳統(tǒng)方法的人為因素干擾. 增加鏡檢樣品數(shù)和拍照次數(shù)，可提高定量分析數(shù)據(jù)穩(wěn)定性. 倒置顯微鏡拍照法減少人為鏡檢不專業(yè)因素，為浮游植物長期觀測數(shù)據(jù)可靠性奠定基礎(chǔ).

2)倒置顯微鏡拍照法比計數(shù)框行格法、目鏡視野法、目鏡行格法、倒置顯微鏡計數(shù)法對浮游植物計數(shù)更加穩(wěn)定. 建議國家標(biāo)準(zhǔn)將倒置顯微鏡拍照法列為國家標(biāo)準(zhǔn)，有利于統(tǒng)一浮游植物定量分析的穩(wěn)定性，有利于建立浮游植物大數(shù)據(jù)中心和浮游植物自動識別鑒定分析系統(tǒng)，更加有利于湖泊河流生態(tài)健康評價.