肝脾硬度與急性髓系白血病微小殘留病的相關(guān)性研究

王寧方 趙崇山 尤月明 王毅軍 蔡卓紋 張東東 劉芳

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,Aml)是發(fā)生于造血干/祖細(xì)胞的惡性增殖性疾病，完全緩解(CR)后復(fù)發(fā)是影響患者長期生存重要因素。微小殘留病(minimal residual disease，MRD)是復(fù)發(fā)的主要根源。微小殘留病是指白血病經(jīng)誘導(dǎo)化療獲完全緩解后或骨髓移植治療后體內(nèi)仍殘留<109的白血病細(xì)胞。白血病患者白血病細(xì)胞可延沿肝脾血竇分布，彌漫性浸潤血管、肝小葉、脾索，腫瘤細(xì)胞不斷增殖，可形成結(jié)節(jié)，并向鄰近的 組織浸潤，有時甚至形成腫塊[1]。鄧怡等發(fā)現(xiàn)在 L615 細(xì)胞低瘤負(fù)荷的MRD小鼠模型中，骨髓移植后17 d肝臟正常結(jié)構(gòu)破壞，肝竇內(nèi)存在大量白血病細(xì)胞，脾臟白髓和紅髓等正常結(jié)構(gòu)消失，有大量白血病細(xì)胞[2]。不管是白血病或MRD，均可發(fā)現(xiàn)白血病細(xì)胞肝脾浸潤，引起肝脾損害，進(jìn)而引起影像學(xué)改變。2003年法國學(xué)者Sandrin等[3]根據(jù)聲波傳導(dǎo)速率與組織硬度相關(guān)的原理，發(fā)明一種切變彈性探測儀，發(fā)現(xiàn)測量值與肝纖維化分期顯著相關(guān)。FS檢測作為一種瞬時彈性成像技術(shù)可以通過檢測肝臟及脾臟對超聲波傳導(dǎo)的速度推測肝臟及脾臟硬度，以其無創(chuàng)檢測的優(yōu)勢在肝病領(lǐng)域應(yīng)用較廣泛。普通體檢人群中也有應(yīng)用研究。目前尚無關(guān)于Aml患者肝脾硬度檢測及其與MRD相關(guān)性的研究。本研究分別以Aml患者、慢性肝病肝硬化及健康人群作為研究對象，檢測3組人群肝脾硬度情況，用流式細(xì)胞儀行MRD檢測，進(jìn)一步分析Aml患者不同時間點(diǎn)肝脾硬度與MRD的相關(guān)性，進(jìn)一步評估預(yù)后，指導(dǎo)診療，結(jié)果如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院收治的初治急性髓系白血病(除外急性早幼粒細(xì)胞白血病M3)患者共100例為試驗(yàn)組，男62例，女38例；年齡23～66歲，平均 (44.14±12.17) 歲；免疫分型FAB分型 ：M0 3例，M1 15例，m248例，M4 18例，M5 16例[4]。陰性對照組為我院體檢健康志愿者30例，其中男20例，女10例；年齡19～63歲，平均(42.32±10.49)歲。陽性對照組為慢性肝病、肝硬化者30例，其中男21例，女9例；慢性肝病18例，肝硬化12例；年齡22～65歲，平均(45.39±11.43)歲。3組患者的年齡、性別比等基線資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) Aml參照WHO(2016)造血和淋巴組織腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)，診斷外周血或骨髓原始細(xì)胞比例下限為0.2，當(dāng)患者被證實(shí)有克隆性重現(xiàn)性細(xì)胞遺傳學(xué)異常t(8;21)(q22;q22)、inv(16)(p13q22)、t(16；16)(p13q22)，即使原始細(xì)胞<0.2，也應(yīng)診斷為Aml。所有患者初診時均行血常規(guī)、生化、出凝血、外周血涂片、骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞免疫分型、細(xì)胞/分子遺傳學(xué)等檢查[4]。慢性肝病肝硬化的診斷依據(jù)《肝硬化中西醫(yī)結(jié)合診療共識》[5]確診。慢性肝炎的診斷依據(jù)《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》[6]的診斷。

1.3 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 納入標(biāo)準(zhǔn):試驗(yàn)組：經(jīng)過骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞免疫分型、細(xì)胞/分子遺傳學(xué)等檢查明確診斷Aml(非M3)者。慢性肝病肝硬化失代償期，肝功能Child-Pugh B、C 級。陰性對照組：健康體檢正常者。以上入組的研究對象均自愿參加，并自愿簽署知情同意書。

1.3.2 排除標(biāo)準(zhǔn):急性早幼粒細(xì)胞白血病，復(fù)發(fā)急性髓系白血病，急性髓系白血病合并自身免疫性肝病、乙型病毒性肝炎、丙型病毒性肝炎、酒精性肝病、藥物性肝炎等急、慢性肝病。陽性對照組除外并發(fā)上消化道出血、肝性腦病、自發(fā)性腹膜炎、肝腎綜合征和原發(fā)性肝癌等患者。

1.3.3 脫落、剔除及中止標(biāo)準(zhǔn):如經(jīng)知情同意、并篩選合格進(jìn)入隨機(jī)化試驗(yàn)的受試者，因故未完成本方案所規(guī)定的療程及觀察周期，作為脫落病例；如不符合納入標(biāo)準(zhǔn)而納入，未遵循試驗(yàn)方案者予以剔除；患者要求退出試驗(yàn)，或未按規(guī)定時間隨訪，死亡者，視為中止。

1.4 方法

1.4.1 相關(guān)指標(biāo)檢測:試驗(yàn)組在首次誘導(dǎo)緩解治療結(jié)束后第14天、鞏固治療結(jié)束后行骨髓穿刺術(shù)，抽取肝素抗凝骨髓血3 ml，利用流式細(xì)胞術(shù) (FCM)行MRD檢測。試驗(yàn)組在首次誘導(dǎo)緩解治療結(jié)束后第14天、鞏固治療結(jié)束后行骨髓穿刺術(shù)，抽取肝素抗凝骨髓血3 ml，利用流式細(xì)胞術(shù) (FCM)(美國Becton,Dickinson and Company)行MRD檢測。白血病相關(guān)免疫表型(leukemiaassociated immuno phenotypes，LAIP)的確定依據(jù)其初診時的免疫表型資料。選取2個或以上的LAIP組合作MRD的檢測，首選淋巴細(xì)胞系交叉抗原陽性細(xì)胞，其次選擇表達(dá)缺失的抗原以及不同期表達(dá)抗原。采用BD CellQuest Pro軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的獲取和分析。設(shè)定參考值以 MRD≥10-4為陽性。按MRD水平<10-4，≥10-4且<10-3,≥10-3且<10-2，≥10-2分為A、B、C、D 4組。

1.4.2 肝脾硬度檢測：分別對試驗(yàn)組患者初診時及首次誘導(dǎo)緩解治療結(jié)束后第14天、鞏固治療結(jié)束后進(jìn)行，隨機(jī)檢測對照組肝脾硬度情況。儀器：FibroScan肝臟瞬時彈性檢測儀(法國Echosens公司)。受檢者空腹。取仰臥位，檢測肝硬度時，高舉右臂，最大限度擴(kuò)展肋間隙，將右側(cè)腋前線至腋中線第7～9 肋間作為檢測區(qū)域，同一位置至少獲取10次成功測量，采取中位數(shù)作為最終測定結(jié)果。檢測脾硬度時，高舉左臂，以左側(cè)腋后線9～11肋間隙作為檢測區(qū)域，余同脾硬度檢測。若檢測四分位數(shù)間距≥中位數(shù)值的1/3， 或成功率<60%，表明此次彈性測定值無效[7]。

1.4.3 結(jié)果分析:分析初診時試驗(yàn)組與對照組肝脾硬度情況及臨床相關(guān)性；分析試驗(yàn)組誘導(dǎo)緩解前后肝脾硬度的變化，分析不同時間點(diǎn)不同MRD水平組肝脾硬度的區(qū)別及脾-肝硬度不同分組間MRD的差異。

2 結(jié)果

2.1 初診時試驗(yàn)組與對照組肝脾硬度比較 3組肝硬度及脾肝硬度差值比較差異顯著，兩兩比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，試驗(yàn)組肝硬度低于對照組(P<0.05)，脾肝硬度差值高于對照組(P<0.05)試驗(yàn)組脾硬度高于陰性對照組及陽性對照組,但比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 初診時試驗(yàn)組與對照組肝脾硬度比較

2.2 試驗(yàn)組不同治療時期肝脾硬度比較 試驗(yàn)組患者在誘導(dǎo)緩解后及鞏固治療后，脾硬度及脾肝硬度差值皆有下降的趨勢，不同時期比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 試驗(yàn)組不同治療時期肝脾硬度比較

2.3 試驗(yàn)組不同MRD組間肝脾硬度比較的差異 統(tǒng)計顯示，試驗(yàn)組不同MRD組間脾硬度及脾肝硬度差值皆有升高的趨勢，其中脾-肝硬度差值比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 試驗(yàn)組不同MRD組間肝脾硬度比較的差異

3 討論

Aml是由髓系造血干細(xì)胞前體異?？寺≡斐傻氖且环N骨髓異常增生性疾病，病因尚不明確，近年來研究認(rèn)為可能是環(huán)境和遺傳共同作用的結(jié)果。白血病細(xì)胞存在血液循環(huán)中，在骨髓及其他造血組織中大量繁殖積聚，并浸潤其他臟器及組織，使得正常造血機(jī)制受到抑制[8]，其中肝臟和脾臟浸潤最為常見。童佳佳等[9]通過影像學(xué)研究證實(shí)，約一半的白血病患者發(fā)生脾浸潤，表現(xiàn)為脾臟體積增大或放射性攝取增高，脾臟越大則預(yù)后越差，生存期越短。且脾臟為白血病細(xì)胞增殖提供了一個有力的生存環(huán)境，并使其在骨髓、血液、脾臟之間往返循環(huán)。

肝臟是人體最為活躍的器官，具有多種代謝功能及雙重血液供應(yīng)功能；脾臟是人體最大的淋巴器官，為網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的重要組成部分，是人體的血庫。Aml患者肝脾腫大的可能原因?yàn)椋篈ml患者骨髓造血出現(xiàn)障礙，導(dǎo)致嚴(yán)重貧血，肝、脾可恢復(fù)造血功能，產(chǎn)生髓外造血，導(dǎo)致增生性肝、脾腫大。肝臟血運(yùn)豐富，脾臟是血細(xì)胞的儲存場所，脾充血可使脾腫大，而惡性血液病導(dǎo)致淋巴結(jié)腫大，造成局部壓迫，使得肝靜脈回流受阻或脾靜脈受阻，可引起脾臟腫大。此外，Aml化療的同時也會對肝細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性，引起肝細(xì)胞損傷、 變性，甚至壞死等改變。其病理基礎(chǔ)為腫瘤細(xì)胞增生和浸潤、出血，血管內(nèi)淤滯[10]。

彈性是人體器官組織重要的物理特征之一，不同的器官組織彈性也不同。Aml患者肝脾瘀血，腫大，組織增生和大量纖維結(jié)締組織的形成，使其密度增加，彈性改變。近些年，關(guān)于利用超聲彈性成像技術(shù)無創(chuàng)評估病變區(qū)組織的硬度的研究越來越多。有實(shí)時組織彈性成像技術(shù)、FS和聲脈沖輻射力成像技術(shù)等[11,12]。FS使用彈性波和超聲波進(jìn)行工作。儀器通過探頭振動軸發(fā)出低頻率低振幅彈性波，彈性波進(jìn)入體內(nèi)在組織中傳播，探頭上的超聲換能器進(jìn)行連續(xù)的超聲采集以跟蹤彈性波的傳播并測量其速度，并使用特定的運(yùn)算法則將速率轉(zhuǎn)變?yōu)橛捕戎怠Ｒ蚱錈o創(chuàng)、無痛、定量、可多時間點(diǎn)重復(fù)測量，其在肝組織上采集信息的體積為肝穿刺標(biāo)本量的100倍左右，能夠通過檢測肝臟硬度值來判斷肝纖維化，效能優(yōu)于各種血清生物學(xué)標(biāo)志物，與肝臟組織生物學(xué)相關(guān)性較好[13,14]。也是測定非酒精性脂肪肝、病毒性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、肝炎后肝硬化的有效方法應(yīng)用，彈性值與肝硬化程度存在相關(guān)性。已有用FS檢測脾硬度的報道，發(fā)現(xiàn)慢性肝病患者肝脾硬度存在顯著正相關(guān)，且隨著肝硬化程度增加，肝脾硬度值增加[15]，結(jié)合肝臟硬度及脾臟硬度的檢測并進(jìn)行評分，可以預(yù)測食管胃底靜脈曲張破裂出血[16]。Colecchia等[17]發(fā)現(xiàn)脾硬度或可用來預(yù)測HCV 感染失代償性肝硬化的發(fā)生，準(zhǔn)確性與門脈壓相當(dāng)。在肝病方面，肝脾硬度檢測或可部分替代肝穿活檢、門脈壓測定、胃鏡等有創(chuàng)操作[18]。FS在血液病方面，僅有關(guān)于造血干細(xì)胞移植后肝纖維化方面的報道，如Pillon M等用FS對造血干細(xì)胞移植后患兒行肝臟硬度檢測，發(fā)現(xiàn)肝纖維化發(fā)生比例很高(9/12)，筆者尚未發(fā)現(xiàn)檢測Aml MRD患者肝脾硬度及分析其與MRD相關(guān)性的研究。本研究初步研究顯示，Aml組脾-肝硬度與對照組不同，肝硬度低于對照組(P<0.05)，脾硬度、脾肝硬度差值高于對照組；而經(jīng)誘導(dǎo)化療及鞏固治療后，Aml患者脾硬度、脾肝硬差值均較化療前下降。提示脾硬度、脾-肝硬度下降可能提示病情緩解。

隨著時代的進(jìn)步，白血病的治療不僅是提高完全緩解率和延長患者的生存時間，還包括控制MRD，最終治愈白血病。MRD是白血病復(fù)發(fā)的根源，是影響患者生存的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)，Aml鞏固治療后MRD水平與無復(fù)發(fā)生存和總生存都相關(guān)，鞏固治療后MRD>3.5×10-4患者復(fù)發(fā)危險(77%)明顯高于MRD小于3.5×10-4者(17%)[19]。San Miguel等[20]根據(jù)誘導(dǎo)治療后MRD水平，將患者分為<10-4，≥10-4且<10-3,≥10-3且<10-2，≥10-24組，統(tǒng)計顯示3年累積復(fù)發(fā)率分別為0、14%、50%、84%，提示MRD水平是Aml的獨(dú)立預(yù)后因素。對Aml治療后MRD進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測，并依據(jù)MRD水平對白血病緩解后實(shí)行動態(tài)分層治療，有望減少復(fù)發(fā)，延長患者生存。MRD的精確檢測有助于更早的發(fā)現(xiàn)藥物耐藥性，更早預(yù)測白血病復(fù)發(fā)，指導(dǎo)診療。白血病患者病初體內(nèi)有1012白血病細(xì)胞，誘導(dǎo)緩解后白血病細(xì)胞降至1010，形態(tài)學(xué)檢測就難以發(fā)現(xiàn)了。流式細(xì)胞儀利用白血病細(xì)胞免疫表型辨別白血病細(xì)胞，靈敏度可達(dá)10-4，即便如此患者體內(nèi)仍可能存在108的白血病細(xì)胞，且白血病治療過程中及復(fù)發(fā)時免疫表型可能會發(fā)生變化，由此造成假陰性結(jié)果。故尋找新的輔助檢測方法動態(tài)監(jiān)測MRD非常重要。FS檢測肝脾硬度相對無創(chuàng)，可多時間點(diǎn)重復(fù)操作，或可用來輔助MRD監(jiān)測。本研究監(jiān)測不同MRD水平的肝脾硬度，顯示隨著MRD水平的升高，脾硬度及脾肝硬度差值皆有升高的趨勢，提示肝脾硬度可能與MRD相關(guān)，肝脾硬度升高可能提示疾病復(fù)發(fā)。

綜上所述，采用FS檢測可能為急性髓系白血病MRD新的輔助判斷預(yù)后，指導(dǎo)診療的無創(chuàng)檢測指標(biāo)，有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量研究。