血清lncRNA EWSAT1和SPRY4-IT1水平檢測對卵巢癌的診斷及預后預測價值分析

周倩 郝爍月 陳鳳 張海燕

卵巢癌是女性中最常見和最致命的惡性腫瘤，其發(fā)病率近年來逐漸增加[1,2]。 目前卵巢癌的主要治療方法仍然依賴于化療或放療，隨著生物技術(shù)和基因工程的發(fā)展，腫瘤發(fā)病過程中差異基因表達的研究可以促進個體化治療和藥物輸送，從而使其成為癌癥診斷、治療的有效靶基因的關(guān)鍵[3,4]。lncRNA EWSAT1主要參與胚胎發(fā)育和血管生成的調(diào)節(jié)，其異常激活與腫瘤的發(fā)病機制和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，lncRNA EWSAT1與c-met之間的結(jié)合激活細胞內(nèi)酪氨酸激酶磷，進一步調(diào)節(jié)含有PI3K，ERK1/2和FAK的多個下游信號通路，從而調(diào)節(jié)腫瘤細胞的各種生物學功能[5]。先前的研究表明，lncRNA EWSAT1的上調(diào)可以降低細胞間粘附并促進細胞轉(zhuǎn)移。SPRY4-IT廣泛分布于細胞和組織中，通過與靶基因的完全互補結(jié)合發(fā)揮調(diào)節(jié)功能，直接降解靶基因mRNA或阻斷轉(zhuǎn)錄后期或翻譯期的基因翻譯，發(fā)揮其癌基因和腫瘤抑制基因的功能，調(diào)節(jié)生物學行為，包括細胞增殖或凋亡，并與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[6,7]。目前關(guān)于血清lncRNA EWSAT1和SPRY4-IT1與卵巢癌診斷及預后預測價值分析較少。本研究擬探討血清lncRNA EWSAT1和SPRY4-IT1在卵巢癌中的表達及其與臨床病理特征的關(guān)系，為卵巢癌的診斷及預后預測價值分析提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年1月至2016年2月在我院行手術(shù)治療并經(jīng)病理證實的卵巢癌患者138例為病例組，年齡為40～74歲，平均(57.5±17.8)歲；病程9個月～4年；其中絕經(jīng)70例，未絕經(jīng)68例；未分化癌8例，子宮內(nèi)膜樣癌6例，透明細胞癌4例，混合型腺癌20例，漿液性腺癌82例，黏液性腺癌18例。所有患者行輔助檢查：血常規(guī)、尿常規(guī)、血生化、卵巢病理組織檢查。符合美國國家綜合癌癥網(wǎng)(National Compre-hensive Cancer Network，NCCN)公布的2012版《Ovarian cancer,version 3.2012》中關(guān)于卵巢癌的診斷標準[8]。手術(shù)切除標本后行病理檢查以判定腫瘤最大徑、病理學分級、TMN分期、浸潤深度、有無淋巴血管間隙浸潤、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。選取同期本院健康體檢者107例為對照組。患者及對照組自愿提供血清標本，用作分析血清lncRNA EWSAT1和SPRY4-IT1水平的表達。本研究經(jīng)我院倫理委員會審批。

1.2 納入與排除標準 納入標準：既往無精神障礙史，無心理疾患或精神疾病史；所有參加本試驗的人員(或其直系親屬)簽署知情同意書。 排除標準：心功能不全，合并未控制的嚴重高血壓；肝、腎、心功能異常者；呼吸道疾病、周圍血管性疾病或栓塞性疾病者。

1.3 lncRNA EWSAT1和SPRY4-IT1 mRNA在卵巢及卵巢癌組織中表達的測定 TRIzol試劑(Invitrogen，美國)提取血清中總RNA，測定總RNA的濃度和質(zhì)量。 然后使用lncRNA EWSAT1、SPRY4-IT1 mRNA特異性反向引物逆轉(zhuǎn)錄總RNA(0.5 μg)以獲得cDNA(lncRNA EWSAT1正向引物為：GTCGCCATGCAGGGTCCGAGGTATGCGACT；lncRNA EWSAT1反向引物為：CTCGCTTCGACATTGCCTACGAG；SPRY4-IT1 mRNA正向引物為：TCTACGAGGAGGAGATGCAGGTATGCGACT；SPRY4-IT1 mRNA反向引物為：AGTCATAGTCCTGGTCTTCTTCTCC)。反應體系為：正向引物10 μl、反向引物10 μl、RNA模版0.6 μl、超級酶混合物0.2 μl、2×μByr一步法RT-qPCR緩沖液5 μl、去RNA水3.4 μl。循環(huán)如下：95℃持續(xù)10 min，進行40個循環(huán)，持續(xù)15 s溫度60℃。Fast Synergy Brands Green Master Mix法在ABI 7 500實時qPCR上測定miR-20a、BCL-2的相對水平。系統(tǒng)(Thermo Fisher Scientifc)，以U6作為內(nèi)部對照，以2-ΔΔCt作為計算方法，依據(jù)lncRNA EWSAT1和SPRY4-IT1 mRNA 2-ΔΔCt計算結(jié)果，確定lncRNA EWSAT1>3.51，SPRY4-IT1>6.48為陽性。

2 結(jié)果

2.1 2組一般情況比較 2組在是否絕經(jīng)、年齡、身高、體重、TG、HDL-C、LDL-C、舒張壓、收縮壓等一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 2組一般情況比較

2.2 2組血清lncRNA EWSAT1、SPRY4-IT1 mRNA水平比較 病例組血清lncRNA EWSAT1、SPRY4-IT1 mRNA水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組血清lncRNA EWSAT1、SPRY4-IT1 mRNA水平比較

2.3 lncRNA EWSAT1、SPRY4-IT1 mRNA陽性率與卵巢癌患者臨床特征相關(guān)性分析 lncRNA EWSAT1、SPRY4-IT1 mRNA陽性率與腫瘤大小、病理學分級、臨床分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否復發(fā)相關(guān)性明顯，且腫瘤越大、病理學分級越高、臨床分期越高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復發(fā)，lncRNA EWSAT1、SPRY4-IT1 mRNA陽性率越高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 lncRNA EWSAT1、SPRY4-IT1 mRNA陽性率與卵巢癌患者臨床特征相關(guān)性分析 例(%)

2.4 lncRNA EWSAT1+SPRY4-IT1聯(lián)合篩查方法與lncRNA EWSAT1、SPRY4-IT1單獨篩查方法靈敏度、特異度、準確度比較 lncRNA EWSAT1+ SPRY4-IT1聯(lián)合篩查方法靈敏度、特異度、準確度均高于lncRNA EWSAT1、SPRY4-IT1單獨篩查方法，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；lncRNA EWSAT1、SPRY4-IT1單獨篩查方法靈敏度、特異度、準確度相近，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 lncRNA EWSAT1+SPRY4-IT1聯(lián)合篩查方法與lncRNA EWSAT1、SPRY4-IT1單獨篩查方法靈敏度、特異度、準確度比較 %(例)

2.5 lncRNA EWSAT1、 SPRY4-IT1表達水平與卵巢癌患者預后分析 lncRNA EWSAT1、SPRY4-IT1陰性組3年生存率及生存期均明顯高于lncRNA EWSAT1、SPRY4-IT1陽性組(P<0.05)。見表5。

表5 lncRNA EWSAT1、 SPRY4-IT1表達水平與卵巢癌患者預后分析

3 討論

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)中除了宮頸癌和子宮癌之外最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生代表了具有家族遺傳特性的復雜過程，卵巢癌癌細胞遷移、浸潤效力高直接導致患者相對高的死亡率，嚴重威脅卵巢癌患者的預后[9-11]。多項研究表明，腫瘤的發(fā)病過程常伴有癌組織、細胞相關(guān)基因和蛋白因子的過度表達，在乳腺癌，肺癌和肝癌組織中l(wèi)ncRNA EWSAT1過度表達，其通過酪氨酸激酶活性，加強癌細胞與內(nèi)皮細胞的粘附，進而促進細胞遷移和侵襲[12]。此外lncRNA EWSAT1與HGF的結(jié)合進行蛋白質(zhì)磷酸化，激活腫瘤的各種信號通路，例如Raf/MAPK，PI3K和JAK /STAT，進一步調(diào)節(jié)腫瘤細胞增殖，分化，遷移和滲透效力[13,14]。因此，lncRNA EWSAT1在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果顯示，病例組血清lncRNA EWSAT1水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義；lncRNA EWSAT1 mRNA陽性率與腫瘤大小、病理學分級、臨床分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否復發(fā)相關(guān)性明顯，且腫瘤越大、病理學分級越高、臨床分期越高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復發(fā)，lncRNA EWSAT1mRNA陽性率越高，差異有統(tǒng)計學意義；這與上述結(jié)論符合，同時也提示lncRNA EWSAT1可能為卵巢癌的診斷、治療靶點。研究表明，lncRNA EWSAT1 診斷原發(fā)性肝癌的敏感性較高，約在73%～85%，而若將lncRNA EWSAT1的陽性閾值提高20%～30%，其診斷的敏感性和特異性分別將提高5%～8%[15]，本研究結(jié)果顯示，lncRNA EWSAT1對卵巢癌患者的篩査是有效的，其診斷卵巢癌的靈敏度、特異度、準確度分別為78.20%、79.40%、78.70%，可作為卵巢癌的血清學預警指標物。

生物信息學方法發(fā)現(xiàn)SPRY4-IT1在正常肝細胞中低表達或表達，而在腫瘤轉(zhuǎn)化的情況下，SPRY4-IT1立即表現(xiàn)出異常高表達[16]。因此，通過檢測患者體內(nèi)SPRY4-IT1表達情況，并靶向阻斷SPRY4-IT1/c-met途徑，降低SPRY4-IT1表達是抑制腫瘤進一步進展的有效措施[17]。研究同時發(fā)現(xiàn)SPRY4-IT1在各種癌細胞的增殖，凋亡和遷移中發(fā)揮調(diào)節(jié)功能。例如SPRY4-IT1通過介導p53信號通路調(diào)節(jié)癌細胞行為，而SPRY4-IT1通過肺組織中腫瘤抑制基因sprouty 2的表達影響肺癌的發(fā)病、進展20-23；SPRY4-IT1在多種腫瘤細胞表達及相關(guān)調(diào)控機制中的研究基礎(chǔ)提供了它作為臨床上有效診斷及治療癌癥的生物治療靶點。本研究結(jié)果顯示，病例組血清SPRY4-IT1水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義；SPRY4-IT1 mRNA陽性率與腫瘤大小、病理學分級、臨床分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否復發(fā)相關(guān)性明顯，且腫瘤越大、病理學分級越高、臨床分期越高、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復發(fā)，SPRY4-IT1陽性率越高，差異有統(tǒng)計學意義；這與上述結(jié)論符合，說明 SPRY4-IT1可能為卵巢癌的診斷、治療靶點；本研究結(jié)果顯示，SPRY4-IT1診斷卵巢癌的靈敏度、特異度、準確度分別為68.80%、83.10%、76.30%，其具有較高的診斷效力，可作為診斷卵巢癌的敏感生物學標志物。

本研究同時發(fā)現(xiàn)，lncRNA EWSAT1+ SPRY4-IT1聯(lián)合篩查方法靈敏度、特異度、準確度均高于lncRNA EWSAT1、SPRY4-IT1單獨篩查方法，差異有統(tǒng)計學意義；lncRNA EWSAT1、SPRY4-IT1單獨篩查方法靈敏度、特異度、準確度相近，差異無統(tǒng)計學意義；lncRNA EWSAT1、 SPRY4-IT1陰性組3年生存率及生存期均明顯高于lncRNA EWSAT1、 SPRY4-IT1陽性組。說明lncRNA EWSAT1+ SPRY4-IT1聯(lián)合篩查方法診斷卵巢癌靈敏度、特異度、準確度高，適合在臨床上推廣應用；lncRNA EWSAT1、SPRY4-IT1低表達的卵巢癌患者具有較好的預后。

綜上所述，卵巢癌患者血清lncRNA EWSAT1、 SPRY4-IT1升高；ncRNA EWSAT1+ SPRY4-IT1聯(lián)合篩查方法診斷卵巢癌靈敏度、特異度、準確度高，適合在臨床上推廣應用；lncRNA EWSAT1、SPRY4-IT1低表達的卵巢癌患者具有較好的預后。