GLUT3在成人急性淋巴細(xì)胞白血病中的表達(dá)及意義

朱鴻燕 陽梅 何川

急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)是一種起源于淋巴細(xì)胞的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，ALL是成人中最常見的急性白血病類型[1]。成人ALL治療方案較多并可緩解病情，但其復(fù)發(fā)率及其并發(fā)癥發(fā)生率較高且對(duì)化療藥物易產(chǎn)生耐藥性，已嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量及其預(yù)后[2]。目前ALL發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，研究指出高血糖可導(dǎo)致脂代謝等多種代謝異常進(jìn)而影響ALL患者預(yù)后生存時(shí)間[3]。故而相對(duì)穩(wěn)定的血糖水平對(duì)提高ALL患者治療效果及改善患者預(yù)后均具有重要意義。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(glucose transporter，GLUT)可促進(jìn)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的吸收，其中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3(glucose transporter 3,GLUT3)在細(xì)胞攝取葡萄糖的過程中發(fā)揮重要作用[4]。研究表明GLUT3在子宮內(nèi)膜癌等多種惡性腫瘤中均呈高表達(dá)，并可促進(jìn)疾病進(jìn)展，同時(shí)其與子宮內(nèi)膜癌等腫瘤細(xì)胞惡性程度及患者預(yù)后不良密切相關(guān)[5]。關(guān)于GLUT3在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中的研究相對(duì)較少，因此，本研究通過檢測(cè)GLUT3在成人ALL患者中的表達(dá)并分析其與患者臨床指標(biāo)的相關(guān)性，初步探討其在ALL發(fā)生及發(fā)展過程中的作用及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年2月至2016年3月在本院就診的成人初診ALL患者78例為ALL組，ALL患者均經(jīng)骨髓細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)、免疫分型檢查及分子生物學(xué)等確診。ALL組中男40例，女38例；年齡25～55歲，平均(35.26±7.75)歲。根據(jù)免疫分型檢查、骨髓細(xì)胞學(xué)及分子生物學(xué)檢查結(jié)果將ALL患者分為B系A(chǔ)LL(B-ALL)49例，T系A(chǔ)LL(T-ALL)29例；Ph陽性患者15例，Ph陰性患者63例。同時(shí)選取40例非血液系統(tǒng)疾病患者為對(duì)照組，其中男23例，女17例；年齡19～60歲，平均(37.17±6.71)歲。2組受試者年齡、性別比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)四川大學(xué)華西醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均知情且簽署知情同意書。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn)：所有ALL患者接受化療；年齡≥18歲；臨床資料完整者；ALL患者復(fù)查時(shí)接受骨髓評(píng)價(jià)療效者；對(duì)照組受試者均無急慢性感染或血液系統(tǒng)疾病。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：合并惡性腫瘤者；肝腎功能嚴(yán)重障礙者；合并自身免疫性疾病患者；合并其他系統(tǒng)嚴(yán)重疾病者；精神疾病患者。

1.3 方法

1.3.1 治療方案及其效果評(píng)估:成人ALL患者按照《中國(guó)成人急性淋巴細(xì)胞白血病診斷與治療專家共識(shí)》中的治療方案進(jìn)行治療[6]，ALL患者均治療1個(gè)療程，治療結(jié)束后評(píng)價(jià)其治療效果，其中所有ALL患者初診前均未進(jìn)行化療或ALL相關(guān)治療，1個(gè)療程治療后52例ALL患者完全緩解，26例ALL患者未完全緩解。

1.3.2 骨髓單個(gè)核細(xì)胞分離:無菌環(huán)境下分別抽取所有受試者骨髓5 ml，置于抗凝試管內(nèi)，按照等體積比將其加入Ficoll分離液(上海根生生物科技有限公司)，放入離心機(jī)內(nèi)離心，轉(zhuǎn)速為1 500 r/min，離心時(shí)間為15 min，將離心后試管中層內(nèi)單個(gè)核細(xì)胞吸出并調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106ml，置于-80℃超低溫冰箱保存。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)骨髓單個(gè)核細(xì)胞中GLUT3基因表達(dá)水平:取出骨髓單個(gè)核細(xì)胞并加入細(xì)胞裂解液(上海通蔚生物有限公司)裂解，分別加入1 ml Invitrogen TRIzol試劑(美國(guó)Thermo Fisher公司)提取總RNA，利用紫外分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司)檢測(cè)總RNA純度，以A260/A280≥1.80為合格RNA進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Promega公司)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為模板單鏈cDNA，以cDNA為模板按照SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(日本Takara公司)進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。GLUT3基因引物序列：正向引物5’-GTGTCTCCCACTGCCCTAC-3’，方向引物5’-GCCCAGAATAAAGTCCAAA-3’；內(nèi)參基因GADPH引物序列：正向引物5’-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3’，反向引物5’-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3’。引物均由上海生物工程股份有限公司合成。qRT-PCR反應(yīng)體系：2×定量PCR Master Mix混合液10 μl，正反向引物(終濃度分別為0.08 μmol/L)各0.08 μl，cDNA模板2 μl，Taq DNA聚合酶 0.4 μl，ddH2O 7.44 μl。每個(gè)樣品均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。qRT-PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，連續(xù)進(jìn)行38次循環(huán)并分別擴(kuò)增3次，GLUT3以GADPH為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法分析骨髓單個(gè)核細(xì)胞中GLUT3基因相對(duì)表達(dá)量。

1.4 隨訪 通過查閱病例資料、復(fù)診及電話隨訪等方法對(duì)ALL患者進(jìn)行隨訪，隨訪截止時(shí)間為2018年12月31日，統(tǒng)計(jì)ALL患者從初診至死亡或末次隨訪時(shí)間(總生存，OS)，并統(tǒng)計(jì)ALL患者治療后從完全緩解開始至首次白血病復(fù)發(fā)或死亡或末次隨訪時(shí)間(無病生存，DFS)。

2 結(jié)果

2.1 成人初診時(shí)ALL患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中GLUT3表達(dá)水平 ALL組患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中GLUT3表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，ALL不同分型B-ALL與T-ALL患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中GLUT3表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，B-ALL與T-ALL比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；ALL不同分型Ph陽性組與Ph陰性組患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中GLUT3表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，Ph陽性組與Ph陰性組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 成人初診時(shí)ALL患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中GLUT3表達(dá)水平

2.2 不同治療效果成人ALL患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中GLUT3表達(dá)水平 完全緩解組ALL患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中GLUT3表達(dá)水平顯著低于未完全緩解組(P<0.05)。見表2。

表2 不同治療效果成人ALL患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中GLUT3表達(dá)水平

2.3 GLUT3表達(dá)與成人初診時(shí)ALL患者臨床指標(biāo)的關(guān)系 根據(jù)成人初診時(shí)ALL患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中GLUT3表達(dá)水平平均值將其分為高表達(dá)組(48例)與低表達(dá)組(30例)，比較GLUT3表達(dá)與成人初診時(shí)ALL患者臨床指標(biāo)的關(guān)系，結(jié)果顯示GLUT3表達(dá)水平與ALL患者年齡、WBC數(shù)目、血紅蛋白、髓外侵犯明顯相關(guān)(P<0.05)。見表3。

表3 GLUT3表達(dá)與成人初診時(shí)ALL患者臨床指標(biāo)的關(guān)系 例(%)

2.4 影響成人ALL患者預(yù)后的多因素分析 將單因素分析中對(duì)成人ALL患者OS與DFS有意義的因素納入COX回歸模型分析，結(jié)果顯示年齡、白血病髓外侵犯及GLUT3高表達(dá)是影響ALL患者OS與DFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表4。

表4 影響成人ALL患者預(yù)后的COX多因素分析

2.5 影響成人ALL患者預(yù)后的單因素分析 將影響成人ALL患者預(yù)后的相關(guān)因素進(jìn)行單因素分析，結(jié)果顯示年齡、WBC數(shù)目、血紅蛋白、髓外侵犯及GLUT3表達(dá)均為影響成人ALL患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見表5。

表5 影響成人ALL患者預(yù)后的單因素分析

3 討論

ALL患者體內(nèi)白血病細(xì)胞惡性增殖并浸潤(rùn)骨髓及其他周圍組織器官進(jìn)而抑制正常造血功能，目前臨床已有新型化療藥物治療ALL，但早期診斷與針對(duì)性治療ALL對(duì)改善患者預(yù)后具有重要意義[7]。因此，探尋ALL早期診斷及評(píng)估患者預(yù)后的新型指標(biāo)對(duì)提高治療效果具有重要應(yīng)用價(jià)值。

GLUT3在肺癌組織中呈高表達(dá)并可通過促進(jìn)癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，同時(shí)GLUT3高表達(dá)與乳腺癌惡性病變存在明顯相關(guān)性[8，9]。研究表明缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)可通過上調(diào)惡性腫瘤中GLUT3表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)生及發(fā)展[10]。另有研究指出白血病患者脊髓缺氧微環(huán)境可促進(jìn)白血病細(xì)胞增殖，缺氧環(huán)境下HIF-1表達(dá)水平升高并可促進(jìn)白血病細(xì)胞分化及侵襲[11]。由此猜測(cè)成人ALL患者脊髓微環(huán)境處于缺氧狀態(tài)促使HIF-1表達(dá)水平升高并可通過上調(diào)GLUT3表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)白血病細(xì)胞增殖及侵襲導(dǎo)致病情加重。本研究檢測(cè)成人ALL患者脊髓單個(gè)核細(xì)胞中GLUT3表達(dá)，結(jié)果顯示ALL組患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中GLUT3表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，其中B-ALL、T-ALL與Ph陽性組、Ph陰性組患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中GLUT3表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組，說明GLUT3在成人ALL患者脊髓單個(gè)核細(xì)胞中呈高表達(dá)并可能參與疾病發(fā)生過程，但GLUT3表達(dá)與ALL不同分型無關(guān)。提示成人ALL患者骨髓微環(huán)境可能處于缺氧狀態(tài)從而促使GLUT3表達(dá)水平升高導(dǎo)致疾病嚴(yán)重程度增加。同時(shí)成人ALL患者經(jīng)1個(gè)療程治療后分為完全緩解組與未完全緩解組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)完全緩解組ALL患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞中GLUT3表達(dá)水平顯著低于未完全緩解組，提示GLUT3表達(dá)水平可能與成人ALL患者化療效果有關(guān)并可能促使化療耐藥性的發(fā)生。

年齡、WBC數(shù)目、血紅蛋白、是否發(fā)生髓外侵犯等均為ALL患者臨床指標(biāo)并與患者預(yù)后密切相關(guān)[12]。本研究根據(jù)成人ALL患者初診時(shí)GLUT3表達(dá)水平平均值將其分為高表達(dá)組與低表達(dá)組，分析其與ALL患者臨床指標(biāo)的相關(guān)性，結(jié)果顯示隨著ALL患者年齡的增加、WBC數(shù)目增多、血紅蛋白含量增加及白血病細(xì)胞發(fā)生髓外侵犯GLUT3表達(dá)水平明顯升高，提示GLUT3可能參與成人ALL發(fā)展過程。同時(shí)GLUT3還與神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲及遷移密切相關(guān)，并與腫瘤病理分期及患者預(yù)后有關(guān)[13，14]。研究指出ALL患者年齡越高其OS與DFS生存時(shí)間越低，WBC數(shù)目越高ALL患者OS與DFS越低，是否伴有白血病細(xì)胞髓外侵犯均可作為預(yù)測(cè)ALL患者預(yù)后的重要指標(biāo)[15]。本研究采用單因素分析法對(duì)影響成人ALL患者預(yù)后的相關(guān)因素進(jìn)行分析，結(jié)果顯示年齡、WBC數(shù)目、血紅蛋白、髓外侵犯及GLUT3表達(dá)均為影響成人ALL患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素，進(jìn)一步采用COX回歸模型進(jìn)行多因素分析，結(jié)果顯示年齡、白血病髓外侵犯及GLUT3高表達(dá)是影響ALL患者OS與DFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示成人ALL患者骨髓單個(gè)細(xì)胞中GLUT3表達(dá)水平可作為評(píng)估患者預(yù)后潛在的重要指標(biāo)。

綜上所述，成人ALL患者骨髓單個(gè)細(xì)胞中GLUT3呈高表達(dá)并可參與該疾病發(fā)生及發(fā)展過程，其與ALL患者臨床指標(biāo)及化療耐藥密切相關(guān)，并可能作為評(píng)估成人ALL患者預(yù)后的重要指標(biāo)，可為成人ALL治療提供新型靶點(diǎn)。但GLUT3在成人ALL發(fā)生及發(fā)展過程中的具體作用機(jī)制有待深入研究。