南方紅豆杉不同部位紫杉烷類含量累積規(guī)律分析*

葉 冰,華成坤，梁淑妍，王穎芳

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部 (廣州 510405 );2.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院 (廣州 510405)

南方紅豆杉Taxus mairei[(Lemee et Levl)S.Y.Hu ex Liu]又稱美麗紅豆杉，是紅豆杉屬中生長(zhǎng)速度最快的品種，為中國(guó)特有[1-2]，紫杉醇(Taxol)作為南方紅豆杉中一種次生代謝產(chǎn)物，是目前公認(rèn)的廣譜、活性強(qiáng)的抗癌藥物之一[3]。然而，紫杉醇天然資源十分有限，主要存在于紅豆杉科植物樹皮及嫩枝中且含量極低，尋找及擴(kuò)大紫杉醇藥源成為醫(yī)藥領(lǐng)域研究人員關(guān)注的重點(diǎn)[4-5]。近年來對(duì)于紅豆杉中抗癌有效物質(zhì)的研究發(fā)現(xiàn)，紅豆杉植物中存在大量的具有三環(huán)二萜的基本骨架化合物——紫杉烷類物質(zhì)，并在其中一些發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤活性[6]且與紫杉醇存在一定的化學(xué)相關(guān)性成分，可通過直接生物合成或者間接的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化形成紫杉醇[7-8]。

經(jīng)早期研究及相關(guān)文獻(xiàn)顯示[9]，8～9月為南方紅豆杉紫衫烷類物質(zhì)的最佳采收季節(jié)，但對(duì)于此時(shí)其不同部位的紫衫烷類含量分布情況缺乏有效考察。本文由此出發(fā)，對(duì)南方紅豆杉中不同部位紫杉烷類物質(zhì)分布及其含量積累的規(guī)律進(jìn)行分析。

材料與方法

1 藥 材 南方紅豆杉樣品采自于遵義市播州區(qū)景森紅豆杉種植場(chǎng)10年生植物，經(jīng)藥學(xué)系專人鑒定為紅豆杉科紅豆杉屬南方紅豆杉，8月初于種植場(chǎng)隨機(jī)選取10株紅豆杉，分別采集其主干樹皮、側(cè)枝樹皮(側(cè)皮)、根皮、須根、莖(嫩枝)、葉等6個(gè)組織器官。將藥材陰干，粉碎，粉末過60目篩，備用。

2 儀器與試藥 紫杉醇(批號(hào)：180381-181124)，三尖杉寧堿(批號(hào)：180926-201802)，7-表-10-去乙?；仙即?批號(hào)：180925-181022)對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ(批號(hào)：BW6337)購(gòu)自北京北研綠生物技術(shù)有限公司；色譜甲醇(批號(hào)：382993)購(gòu)自天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司；正己烷(批號(hào)：20180314)購(gòu)自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；二氯甲烷(批號(hào)：20180503)購(gòu)自天津永大化學(xué)試劑有限公司；水為超純水，其他試劑均為分析純。

AB135-S電子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；AR224CN電子分析天平[奧豪斯儀器(上海)有限公司]；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；Dionex UltiMate3000型液相色譜儀[Dionex(中國(guó))有限公司]；色譜柱inertsil ODS-SP(250×4.6 mm,5 μm，日本島津)。

3 研究方法

3.1 色譜條件：色譜條件為：HPLC儀為日本島津SPD-20A全自動(dòng)高效液相色譜儀,色譜柱為inertsil ODS-SP(250×4.6 mm，5 μm)柱，柱溫：30 ℃，流動(dòng)相為甲醇∶水(0～16 min，44%；16～20 min，44%～62%；20～25 min，62～67%；25～30 min，67%～70%；30～35 min，62%～70%；35～40 min，62%)，檢測(cè)波長(zhǎng):227 nm,流速：0.5 ml/min,進(jìn)樣量：5 μl。

3.2 對(duì)照品溶液的制備：分別精密稱取10-DABⅢ、三尖杉寧堿、紫杉醇、7-表-10-去乙?；仙即紭?biāo)準(zhǔn)品適量，用甲醇定容到每1 ml分別含0.0427 mg、0.0248 mg、0.0324 mg、0.0284 mg的混合對(duì)照品溶液，備用。

3.3 供試品溶液的制備：精密稱取制備好干燥的南方紅豆杉樣品，每份1.0 g，置50 ml磨口具塞三角瓶中，分別加入甲醇25 ml，浸潤(rùn)30 min后，超聲提取30 min，超聲頻率為32 kHz，提取2次，抽濾，合并濾液，于30 ℃減壓蒸干，浸膏用45 ml甲醇溶解后加入5 ml蒸餾水，搖勻后，用50 ml正己烷萃取，振蕩多次后，靜置30 min，脫脂，重復(fù)多次至正己烷無色，棄去正己烷層；甲醇相用30 ℃減壓蒸干，浸膏用50 ml二氯甲烷溶解后加入等體積蒸餾水萃取，超聲數(shù)秒，分相后，二氯甲烷層再用水萃取兩次，將二氯甲烷相真空濃縮至干，用5 ml甲醇溶解、定容，用0.45 μm過濾后，HPLC檢測(cè)。

3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：采用25 ml容量瓶分別吸取1、5、10、15、20 ml混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋至刻度，按色譜條件，分別精密吸取10 μl進(jìn)樣，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得結(jié)果如下，該相關(guān)系數(shù)和線性范圍均符合測(cè)定要求。見表1。

表1 四種紫杉烷類成分線性關(guān)系

3.5 精密度試驗(yàn)： 按“色譜條件”項(xiàng)目下檢測(cè)條件，精密吸取供試品10 μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果顯示儀器精密度良好。見表2。

3.6 重復(fù)性試驗(yàn)： 稱取6 份同批次紅豆杉樣品，按“供試品溶液的制備”項(xiàng)目下制備方法制備供試品，進(jìn)樣10 μl，測(cè)定其峰面積，計(jì)算各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)及RSD,結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)方法可靠。見表2。

3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)： 取供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)得峰面積值，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。見表2。

3.8 加樣回收率試驗(yàn)： 取同一批紅豆杉樣品 6 份，每份1.0 g，分別精密加入混合對(duì)照品溶液1.00 ml，按前述方法制備樣品液，測(cè)定其含量，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果表明4種成分回收率符合要求，測(cè)定方法準(zhǔn)確。見表2。

表2 四種紫衫烷類成分方法學(xué)考察(%)

結(jié) 果

分別取南方紅豆杉不同部位藥材等分，精密稱定，按照“供試品溶液的制備”項(xiàng)目下制備方法制備供試品，并按照前述色譜條件進(jìn)行進(jìn)行HPLC檢測(cè)分析，測(cè)定其峰面積后取平均值，其中峰面積代表紫杉烷類成分含量。見表3。

表3 南方紅豆杉不同部位四種紫杉烷類的峰面積(n=10)

對(duì)南方紅豆杉的主干樹皮、側(cè)枝樹皮、根皮、須根、嫩枝、葉等六個(gè)組織及器官對(duì)四個(gè)紫杉烷類含量進(jìn)行分析可知：①10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ在不同組織器官含量相差較大。具體含量分布順序?yàn)椋喝~>莖>主根皮>須根>側(cè)皮>主干樹皮。②三尖杉寧堿在不同組織器官含量分布存在比較明顯的差異，含量分布順序?yàn)椋褐鞲?須根>葉>主干樹皮>莖>側(cè)皮。③紫杉醇在不同組織器官含量分布存在比較明顯的差異，含量分布順序?yàn)椋褐鞲?須根>主干樹皮>葉>莖>側(cè)皮。④7-表-10-去乙酰基紫杉醇在不同組織器官含量分布存在比較明顯的差異，含量分布順序?yàn)椋簜?cè)皮>須根>主根皮>主干樹皮>莖>葉。

討 論

近年來,尋找及擴(kuò)大紫杉醇藥源是一個(gè)十分活躍的研究領(lǐng)域，并取得了較大的進(jìn)展，目前生產(chǎn)紫杉醇的方法主要有植物提取法[10]、紅豆杉細(xì)胞工程法[11]、化學(xué)半合成或全合成法[12]、基因工程法和內(nèi)寄生真菌生產(chǎn)法[13-14]等，但是由于現(xiàn)今的技術(shù)水平的缺陷，人工栽培這種方法對(duì)緩解紫杉醇資源問題似乎更加具有可操作性，是近幾年紫杉醇和重要紫杉烷的重要來源[15]。

經(jīng)文獻(xiàn)[9]及本文早期研究發(fā)現(xiàn)南方紅豆杉紫衫烷類最佳采收季節(jié)為8～9月，而植物在不同季節(jié)其不同部位組分有較大差異，故而有必要重新進(jìn)行考察。本文利用HPLC法測(cè)定10年生南方紅豆杉植株8月的主干樹皮、側(cè)皮、根皮、須根、莖、葉等六個(gè)組織器官中四種紫杉烷類成分含量。結(jié)果由表3可知，10-脫乙酰巴卡亭Ⅲ在葉、莖中含量比較大，在樹皮、根中含量少；三尖杉寧堿在根中含量最高，而在側(cè)皮中幾乎沒有；紫杉醇在根部及主干樹皮中含量較高，7-表-10-去乙酰基紫杉醇則在側(cè)皮中最高，在葉中基本沒有。提示紫杉烷類物質(zhì)在植株不同組織器官的可能分布規(guī)律：葉是合成紫杉醇前體物質(zhì)的主要器官，而皮與根則是合成及積累紫杉醇的主要組織器官。預(yù)測(cè)紫杉烷類在體內(nèi)轉(zhuǎn)移的方式：以水溶性紫杉烷類前體物質(zhì)轉(zhuǎn)移，以紫杉醇的形式在體內(nèi)特定部位如韌皮或次生木質(zhì)部?jī)?chǔ)存，同類組織器官紫杉烷類之間存在相互轉(zhuǎn)化關(guān)系。需要指出的是影響紅豆杉植株中紫杉烷類物質(zhì)積累的因素是十分復(fù)雜的,不同區(qū)域、不同年限等因素均能對(duì)其成分產(chǎn)生影響，后續(xù)還需進(jìn)一步分析，以確定其關(guān)鍵影響因素，為南方紅豆杉的開采及利用提供依據(jù)。