攻下清熱活血方對重癥急性胰腺炎大鼠血清相關(guān)炎性因子及腸黏膜屏障功能的影響研究*

馬明和,劉永萍,劉 萍,顧存玲

1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院 (西寧810000);2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院生化教研室(西寧 810000)

重癥急性胰腺炎(Severe acute pancreatitis，SAP)是臨床上較為常見的一種重癥急腹癥，約為所有急性胰腺炎患者的15%左右，死亡率則可高達(dá)30%。目前，SAP發(fā)病機(jī)制尚未完全明晰，后續(xù)可進(jìn)展為呼吸衰竭、多器官功能障礙綜合征(Multiple organ dysfunction syndrome，MODS)以及膿毒癥等病癥[1]。SAP在發(fā)病初期往往會(huì)合并腸屏障功能障礙(Intestinal barrier dysfunction，IBFD)，從而使得腸黏膜通透性增大。隨著醫(yī)學(xué)界對SAP腸溶性感染以及細(xì)菌易位等的了解逐漸深入，IBFD已為人們所普遍關(guān)注。目前，臨床研究證實(shí)：當(dāng)SAP發(fā)病時(shí)，炎性因子的過度釋放是導(dǎo)致IBFD的一個(gè)非常重要的原因[2-3]。其中，IBFD發(fā)病的重要原因?yàn)榇傺准?xì)胞因子與抗炎細(xì)胞因子水平失衡[4]。對于引起SAP的IBFD，在既往文獻(xiàn)資料報(bào)道中，多集中于小腸絨毛。新近研究表明：TNF-α及IL-1β等炎性因子與SAP疾病的進(jìn)展具有十分緊密的關(guān)聯(lián)性[5]。根據(jù)如上關(guān)于SAP發(fā)病相關(guān)機(jī)制的分析，可為臨床治療該病提供一定的依據(jù)。本研究采用?；悄懰徕c(濃度為3.5%)于胰膽管逆行注射構(gòu)建SAP大鼠模型，對攻下清熱活血中藥對SAP大鼠的療效及其對大鼠血清相關(guān)炎性因子及腸黏膜屏障功能的影響，報(bào)告如下。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇90只SD大鼠，雌雄大鼠各為45只，體重220～280 g，平均(247.69±22.28)g，清潔級，由我院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心所提供。

2 藥品及相關(guān)試劑 攻下清熱活血中藥主要組方包括：生大黃、茵陳、柴胡、郁金以及紅藤等組方構(gòu)成，由本院中藥制劑室制作而成的流浸膏備用； 奧曲肽(國藥準(zhǔn)字 H20100099)； TNF-α及IL-1β檢測用的酶聯(lián)免疫試劑盒均購自于美國RapidBio公司； 戊巴比妥鈉(國藥準(zhǔn)字 H31021725)。

3 動(dòng)物造模 將本組90只SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組與造模組，雌雄各占50%，其中正常對照組大鼠10只，造模組大鼠80只。正常對照組大鼠自由飲水，且給予標(biāo)準(zhǔn)飼料進(jìn)行飼養(yǎng)。造模組大鼠在造模之前12 h禁食，且自由飲水。采用質(zhì)量濃度為50 mg/kg的戊巴比妥鈉于腹腔注射予以麻醉，于正中切口將腹腔切開，實(shí)施胰膽管穿刺之后，使用濃度為3.5%的牛磺膽酸鈉，以1 ml/kg的速度微泵恒壓條件下胰膽管逆行注射，然后關(guān)腹進(jìn)行縫合處理。

4 分組及給藥 由預(yù)實(shí)驗(yàn)的具體情況可以得知，造模組大鼠的死亡率要顯著高于兩治療組，因此在對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行分組時(shí)，將造模組大鼠確定為40只，奧曲肽治療組大鼠20只，攻下清熱活血中藥治療組大鼠20只。待造模過程完成之后開始給藥，奧曲肽組于皮下注射16.0 μg/kg的奧曲肽；中藥組以8.33 g/kg的量灌胃。正常對照組與模型組均給予等劑量的生理鹽水進(jìn)行灌胃，上述操作每次間隔為8 h，共3次。

5 標(biāo)準(zhǔn)采集與分析 ①標(biāo)本采集。大鼠造模完成之后的24 h將大鼠處死，取大鼠血清備用；取胰腺組織及小腸組織，使用濃度為4%的多聚甲醛加以固定，采用酒精進(jìn)行逐級脫水，石蠟切片。②采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA法)對大鼠血清中TNF-α及IL-1β水平進(jìn)行測定分析。③表征腸黏膜屏障功能的黏蛋白(Mucin，MUC2)采用免疫組化法進(jìn)行測定分析。于光學(xué)顯微鏡下予以觀察，每張切片選擇5個(gè)視野，每個(gè)視野選擇100個(gè)細(xì)胞進(jìn)行觀察。陽性表達(dá)判定方法：由于MUC2位于細(xì)胞漿，凡是觀察到棕黃色或者黃色的顆粒則可判定為陽性細(xì)胞，根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例以及陽性細(xì)胞強(qiáng)度進(jìn)行評分。具體評分標(biāo)準(zhǔn)為：①0分：陽性細(xì)胞比例在5%以內(nèi)；②1分：陽性細(xì)胞比例為(5%～30%)；③2分：陽性細(xì)胞比例為(30%～60%)；④3分：陽性細(xì)胞比例在60%以上。陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)為：①0分：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)無染色；②1分：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)染色為淡黃色；③2分：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)染色為黃色；④3分：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)染色為棕黃色。陽性細(xì)胞比例與陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度評分乘積即表示為免疫組化染色評分[6]。

結(jié) 果

1 各組大鼠24 h存活情況比較 奧曲肽組大鼠24 h存活率為40.00%(8/20)，中藥組大鼠24 h存活率為45.00%(9/20)，模型組存活率為25.00%(10/40)。兩治療組大鼠存活率均高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，奧曲肽組與中藥組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2 各組大鼠血清TNF-α及IL-1β水平比較 見表1。模型組、奧曲肽組大鼠血清TNF-α及IL-1β水平均分別高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，奧曲肽組大鼠血清TNF-α及IL-1β水平與模型組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，中藥組大鼠血清TNF-α及IL-1β水平分別顯著低于模型組、奧曲肽組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但中藥組與正常對照組大鼠血清大鼠血清TNF-α及IL-1β水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠血清TNF-α及IL-1β水平比較(μg/ml)

3 各組大鼠MUC2免疫組化評分比較 見表2。采用免疫組化法對各組大鼠MUC2表達(dá)情況進(jìn)行觀察，結(jié)果表明，正常對照組MUC2陽性細(xì)胞表達(dá)率較高，主要為棕黃色或者黃色；模型組與正常對照組相比，MUC2陽性細(xì)胞表達(dá)率較低，染色程度相對較低，免疫組化評分低于正常對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；奧曲肽組MUC2陽性細(xì)胞表達(dá)率顯著高于模型組，中藥組MUC2陽性細(xì)胞表達(dá)率高于奧曲肽組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 各組大鼠MUC2免疫組化評分比較(分)

討 論

祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為，SAP屬“結(jié)胸”“腹痛”等范疇。該病發(fā)病特征為飲食不節(jié)、酗酒、暴飲暴食或者七情內(nèi)傷，對肝膽脾胃產(chǎn)生損傷，導(dǎo)致肝氣邪結(jié)，脾胃運(yùn)化失職，內(nèi)生痰濁，濁邪蘊(yùn)積化熱，引起邪熱蘊(yùn)積，對臟腑產(chǎn)生損傷作用，從而使得腑氣不暢，氣滯血瘀。按照該病的病因以及具體的臨床特征，其病機(jī)主要為邪熱、腑實(shí)以及血瘀等。因此，本研究觀察組將攻下清熱活血中藥用于治療SAP中，其可對胰腺組織病理加以改善，使得血清淀粉酶濃度顯著下降，對SAP大鼠具有十分理想的治療效果。

SAP之所以保持較高病死率，主要是由于其常合并全身炎癥反應(yīng)綜合征(Systemic inflammatory response syndrome，SIRS)及MODS或多器官功能衰竭等癥。而SAP及其誘發(fā)的SIRS、MODS及多器官功能衰竭發(fā)病與TNF-α、IL-1β等炎性因子相關(guān)。上述炎性因子主要源自于內(nèi)毒素刺激的單核-巨噬細(xì)胞，是炎癥急性反應(yīng)早期的常見炎性因子，由于其具有促炎作用，因此常被稱為“促炎因子”。二者可以促使內(nèi)皮細(xì)胞對白細(xì)胞的黏附作用，對內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生刺激性作用，從而分泌產(chǎn)生炎性介質(zhì)，對凝血系統(tǒng)產(chǎn)生激活作用，抑制纖溶以及促使炎性滲出等，從而加快單核-巨噬細(xì)胞釋放出大量的TNF、IL-1、IL-8等因子[7]。目前臨床研究表明[8-10]，TNF-α屬于一種炎性反應(yīng)的啟動(dòng)介質(zhì)，可介導(dǎo)胰腺局部以及全身出現(xiàn)炎性反應(yīng)；而IL-1β雖然并非為SAP啟動(dòng)的必須因子，然而可能為炎癥開始之后加劇以及播散炎癥的重要角色。在SAP發(fā)病初期，胰腺之中的炎性細(xì)胞與胰腺泡細(xì)胞就會(huì)釋放出大量的TNF-α、IL-1β等炎性因子[11-13]。本研究結(jié)果顯示：模型組、奧曲肽組大鼠血清TNF-α及IL-1β水平均分別顯著高于正常對照組，奧曲肽組大鼠血清TNF-α及IL-1β水平均分別顯著小于模型組，中藥組大鼠血清TNF-α及IL-1β水平均分別低于模型組、奧曲肽組，但中藥組與正常對照組大鼠血清大鼠血清TNF-α及IL-1β水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。上述結(jié)果提示，攻下清熱活血中藥對SAP的治療作用主要是通過促使SAP大鼠血清TNF-α及IL-1β水平來實(shí)現(xiàn)的，而中藥如何對SAP細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)多靶點(diǎn)及多環(huán)節(jié)進(jìn)行調(diào)控，尚需更深入地研究。

腸黏液層是有效防御腸道細(xì)菌與有害物質(zhì)侵入的一個(gè)重要屏障，其主要成分為黏蛋白。MUC2是構(gòu)成腸黏液中最為重要的黏蛋白，其數(shù)量與結(jié)構(gòu)的變化同腸黏膜屏障受損存在十分緊密的關(guān)聯(lián)性[14-16]。本研究結(jié)果顯示：正常對照組MUC2陽性細(xì)胞表達(dá)率較高，主要為棕黃色或者黃色；模型組與正常對照組相比，MUC2陽性細(xì)胞表達(dá)率較低，染色程度相對較低，免疫組化評分顯著低于正常對照組；奧曲肽組MUC2陽性細(xì)胞表達(dá)率顯著高于模型組，中藥組MUC2陽性細(xì)胞表達(dá)率顯著高于奧曲肽組。此結(jié)果提示，當(dāng)SAP發(fā)病時(shí)，會(huì)對腸上皮細(xì)胞產(chǎn)生破壞作用，導(dǎo)致MUC2分泌量顯著下降，腸黏膜層由于來源不確切而削弱腸屏障功能；攻下清熱活血中藥能夠有效保護(hù)腸上皮細(xì)胞，使其免遭損傷，使得MUC2分泌量顯著升高，修復(fù)了腸黏膜層，對腸黏膜機(jī)械屏障的完整性具有很好地保護(hù)作用，維持了腸道的正常生理狀態(tài)。

綜上所述，攻下清熱活血中藥可對SAP大鼠具有理想的治療作用，可通過降低血清TNF-α及IL-1β水平來實(shí)現(xiàn)，此外其還對SAP大鼠腸黏膜具有保護(hù)效果，加快腸黏膜屏障功能恢復(fù)。