壯督驅(qū)寒合劑對(duì)強(qiáng)直性脊柱炎模型小鼠miR-29a及Wnt信號(hào)通路的影響*

李 燦,劉 丹,羅常春,柳玉佳,王莘智

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)(長(zhǎng)沙 410208);2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 (長(zhǎng)沙 410021)

強(qiáng)直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis，AS)是一種以中軸關(guān)節(jié)受累為主，伴有葡萄膜炎、腸道炎癥等關(guān)節(jié)外表現(xiàn)，嚴(yán)重者可出現(xiàn)脊柱畸形和關(guān)節(jié)強(qiáng)直的慢性炎癥性疾病[1]。我國(guó)男性患病率顯著高于女性[2-3]。纖維軟骨炎癥、骨侵蝕及新骨形成是AS的三大病理特征[4]，其晚期由于附著點(diǎn)、關(guān)節(jié)軟骨等的骨化造成的難逆性病變是影響疾病預(yù)后的主要原因，因此新骨形成的機(jī)制是目前研究的重點(diǎn)。

壯督驅(qū)寒合劑是我院風(fēng)濕科經(jīng)驗(yàn)方，具有補(bǔ)腎壯督、散寒祛濕、通絡(luò)利節(jié)的功效，經(jīng)臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)壯督驅(qū)寒合劑能夠顯著降低AS患者疾病活動(dòng)程度，改善患者臨床癥狀，且安全可靠。目前研究表明微小RNA(Micro RNA，miRNA)是骨形成及骨重塑過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[5]，其中miR-29a(microRNA 29a，miR-29a)在成骨細(xì)胞分化過(guò)程中表達(dá)上調(diào)[6]，與強(qiáng)直性脊柱炎的骨化密切相關(guān)，它可能通過(guò)下調(diào)DKK-1(Dickkopf1，DKK-1)的表達(dá)來(lái)激活Wnt信號(hào)通路，從而影響AS新骨形成[7]。本研究擬以蛋白聚糖誘導(dǎo)的AS小鼠為模型，通過(guò)檢測(cè)miR-29a及Wnt 通路相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，探討其對(duì)Wnt通路的調(diào)控作用，為壯督驅(qū)寒合劑治療AS提供理論基礎(chǔ)。

材料與方法

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)6～8周雌性Balb/c小鼠(20±2)g，50只，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(湘)2016-0002，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物房，飼以普通飼料，自由攝食攝水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 藥物制備：壯督驅(qū)寒合劑(組成：蒼術(shù)、白術(shù)、杜仲各20 g，獨(dú)活、狗脊、桂枝、乳香、沒(méi)藥各10 g，麻黃、甘草各5 g，所有中藥均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科統(tǒng)一加工為免煎顆粒劑)。塞來(lái)昔布膠囊，國(guó)藥準(zhǔn)字：J20140072，規(guī)格：0.2 g/片。以上藥物均按照體表面積進(jìn)行換算，每公斤體重小鼠的給藥量為人的9.1倍，換算為小鼠等效劑量，現(xiàn)用現(xiàn)溶。

1.3 試劑及儀器：蛋白聚糖(Sigma公司，貨號(hào)：D-8428)；完全弗式佐劑(Sigma公司，貨號(hào)：F5881)；RIPA裂解液(中國(guó)上海碧云天，貨號(hào)：P0013B)；蛋白酶抑制劑(中國(guó)北京金泰宏達(dá)，貨號(hào)：583794)；mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、UltraSYBR Mixture、DM2000 Plus DNA Marker(中國(guó)北京康為世紀(jì)，貨號(hào)：CW2569、CW2141、CW2601、CW0632)；總RNA提取試劑盒Trizol(美國(guó)Thermo，貨號(hào)：15596026)；熒光定量RCP儀、熒光PCR板(美國(guó)Thermo 公司，貨號(hào)：PIKOREAL96、SPL0960)；電泳儀、電泳槽、轉(zhuǎn)膜儀(中國(guó)北京六一，貨號(hào)：DYY-6C、DYCZ-24DN、DYCZ-40D)；生物樣品均質(zhì)儀(中國(guó)杭州奧盛，貨號(hào)：BioPrep-24)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組、模型建立：將小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、西藥組、中藥低劑量組及中藥高劑量組，每組各10只。除空白組外，其余四組均按以下方法復(fù)制為AS模型：將100 μg蛋白聚糖與等體積完全弗氏佐劑混合均勻，腹腔注射蛋白聚糖乳劑0.2 ml，首次免疫分別于第21天、第42天進(jìn)行加強(qiáng)免疫，再次腹腔注射乳劑0.2 ml[8-9]。

2.2 藥物干預(yù)：造模成功后分別灌胃相應(yīng)藥物，1次/d。中藥低劑量組：壯督驅(qū)寒合劑18.2 g/(kg·d)，中藥高劑量組為36.4 g/(kg·d)，西藥組：塞來(lái)昔布60.7 mg/(kg·d)，空白組及模型組予以等量的生理鹽水，連續(xù)8周。密觀小鼠飲食及活動(dòng)狀況。

2.3 動(dòng)物處理：各組小鼠均在藥物干預(yù)8周后脫頸處死，于小鼠膝關(guān)節(jié)處取滑膜組織，立即放入液氮中于-80℃條件下進(jìn)行儲(chǔ)存。

3 指標(biāo)檢測(cè)

3.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)測(cè)定miR-29a、DKK-1及β-catenin的mRNA(messenger RNA，mRNA)：采用Trizol法提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度及純度，RNA濃度(ng/μl)=A260×稀釋倍數(shù)×40，濃度在100 ng/μl～200 ng/μl，RNA純度=OD260/OD280，比值在1.8～2.0之間均可。以組織總mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，運(yùn)用primer5軟件設(shè)計(jì)引物，由上海生工合成引物，采用SYBRGreen PCR試劑盒(TAKARA)，qRT-PCR技術(shù)進(jìn)行基因擴(kuò)增和檢測(cè)。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，每個(gè)標(biāo)本設(shè)置三個(gè)復(fù)孔，采用 2-△△ct法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。β-actin上游序列為5’-ACATCCGTAAAGACCTCTATGCC-3’，下游序列為5’-TACTCCTGCTTGCTGATCCAC-3’，擴(kuò)增長(zhǎng)度為223 bp；TNF-α上游序列為5’-AGCACAGAAAGCATGATCCG-3’，下游序列為5’-CACCCCGAAGTTCAGTAGACA-3’，擴(kuò)增長(zhǎng)度為162 bp，DKK1上游序列為5’-CAGTGCCACCTTGAACTCAGT-3’，下游序列為5’-CCGCCCTCATA

GAGAACTCC-3’，擴(kuò)增長(zhǎng)度為129 bp，β-catenin上游序列為5’-ATGGAGCCGGACAGAAAAGC-3’，下游序列為5’-TGGGAGGTGTCAACATCTTCTT-3’，擴(kuò)增長(zhǎng)度為143 bp；miR-29a引物序列： 5’-ACTGATTTCTTTTGGTGTTCAG-3’。

3.2 免疫印跡法(Western blotting)檢測(cè)β-catenin、DKK-1蛋白含量：取各組骶髂關(guān)節(jié)滑膜組織加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。加入5×loading buffer混勻，沸水煮5 min放入冰盒速冷備用充分變性蛋白。進(jìn)行 SDS-PAGE，轉(zhuǎn)印于NC膜，封閉，加一抗室溫孵育90 min后加二抗室溫孵育90 min，選用ECL化學(xué)發(fā)光液顯色曝光，以β-actin為內(nèi)參，對(duì)雜交帶進(jìn)行掃描分析，比較蛋白的相對(duì)表達(dá)。

結(jié) 果

1 壯督驅(qū)寒合劑對(duì)miR-29a表達(dá)的影響 見(jiàn)表1。與空白組相比，其余各組miR-29a表達(dá)水平均顯著升高(P<0.01)，與模型組相比，其余各組miR-29a表達(dá)水平均顯著下降(P<0.01)，與中藥低劑量組和西藥組相比，中藥高劑量組表達(dá)有所下降(P<0.01)。

2 壯督驅(qū)寒合劑對(duì)Wnt通路相關(guān)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的影響 見(jiàn)表1。與空白組相比，其余各組DKK-1 mRNA表達(dá)水平均顯著下降(P<0.01)，β-catenin mRNA表達(dá)水平均顯著增高(P<0.01)，與模型組相比，其余各組DKK-1 mRNA表達(dá)水平均顯著升高(P<0.01)，β-catenin mRNA表達(dá)水平均顯著下降(P<0.01)，與中藥低劑量組和西藥組相比，中藥高劑量組DKK-1 mRNA表達(dá)升高(P<0.01)，β-catenin mRNA表達(dá)下降(P<0.01)。

表1 各實(shí)驗(yàn)組miR-29a、DKK-1 mRNA及β-catenin mRNA基因定量檢測(cè)2-△△ct值

3 壯督驅(qū)寒合劑對(duì)Wnt通路相關(guān)細(xì)胞因子蛋白表達(dá)的影響 見(jiàn)表2(圖1)。與空白組相比，其余各組DKK-1蛋白表達(dá)均有下降(P<0.05)，β-catenin蛋白表達(dá)均有增高(P<0.05)；與模型組相比，其余各組DKK-1蛋白表達(dá)均有增高(P<0.05)，β-catenin蛋白表達(dá)均有下降(P<0.05)；與中藥低劑量組及西藥組相比，中藥高劑量組DKK-1表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，β-catenin表達(dá)下降。

表2 各實(shí)驗(yàn)組DKK-1、β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量

A.DKK-1 western blot 電泳圖；B:β-catenin western blot 電泳圖

討 論

強(qiáng)直性脊柱炎是一種免疫介導(dǎo)的以骶髂關(guān)節(jié)炎及軸向炎癥為特征的全身性炎癥性疾病[10]，早期表現(xiàn)為炎性腰背及臀部疼痛，晚期由于外纖維環(huán)、韌帶及關(guān)節(jié)軟骨等的骨化逐漸出現(xiàn)“竹節(jié)樣”脊柱[11]。新骨形成、骨量減少、骨質(zhì)疏松等骨代謝異常是AS的特征性表現(xiàn)，其中新骨形成是疾病發(fā)展的重要原因[4,12]。miRNA是調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的短非編碼RNA，調(diào)控著至少1/3的人類編碼蛋白基因，參與了多個(gè)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展，比如強(qiáng)直性脊柱炎。miRNA對(duì)細(xì)胞因子表達(dá)、調(diào)節(jié)T細(xì)胞存活信號(hào)、促炎途徑及骨代謝的調(diào)控在AS的發(fā)病中起重要作用[13]。近期研究表明miRNA對(duì)成骨分化上游信號(hào)、重要信號(hào)通路及下游基因均起到重要調(diào)控作用[14-15]，與AS新骨形成密切相關(guān)，可能通過(guò)經(jīng)典Wnt通路、BMP(Bone morphogenetic protein，BMP)信號(hào)通路參與AS新骨形成[6,16]，其中miR-29a是成骨細(xì)胞分化中不可缺少的代表性miRNA，主要通過(guò)靶向典型 Wnt/β-catenin 通路來(lái)調(diào)控成骨細(xì)胞的分化[13]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路通過(guò)多途徑誘導(dǎo)間充質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞參與骨形態(tài)發(fā)生和骨代謝穩(wěn)態(tài)[17]，是參與AS新骨形成的關(guān)鍵信號(hào)通路，DKK1被認(rèn)為是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的關(guān)鍵抑制因子。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，AS患者中的miR-29a、β-catenin的表達(dá)高于對(duì)照組，Dkk-1的表達(dá)低于對(duì)照組，且miR-29a與Dkk-1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與β-catenin的表達(dá)呈正相關(guān)[18]，表明miR-29a主要通過(guò)下抑制DKK1的表達(dá)從而激活Wnt /β-catenin途徑參與AS新骨形成[7]。因此可以從 miR-29a調(diào)控Wnt/β-catenin 通路來(lái)進(jìn)一步研究中醫(yī)改善 AS骨化的可能機(jī)制。

根據(jù)強(qiáng)直性脊柱炎的臨床特點(diǎn)，中醫(yī)將其歸為痹病范疇。歷代醫(yī)家多認(rèn)為本病由內(nèi)外合邪而致，如《素問(wèn)·生氣通天論》曰：“陽(yáng)氣者，精則養(yǎng)神，柔則養(yǎng)筋。開(kāi)闔不得，寒氣從之，乃生大僂?！薄夺t(yī)宗必讀》言“有寒、有濕、有風(fēng)熱、有挫閃、有瘀血、有滯氣、有痰積，皆標(biāo)也，腎虛其本也?！蔽覀兘Y(jié)合臨床論治經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為本病病機(jī)可歸納為“虛、邪”。腎虛督寒是本病發(fā)病的關(guān)鍵，風(fēng)寒濕等外侵是其誘發(fā)因素，正虛邪侵，日久不愈，痰瘀互結(jié)，終至筋攣骨損，脊背強(qiáng)直廢用。腎藏精，主骨主髓，腎氣虧虛，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)破壞及骨質(zhì)疏松。督脈行于脊背，通于腎，總督人身諸陽(yáng)，風(fēng)寒外襲，寒凝督脈而致筋脈攣急，脊背強(qiáng)直，屈伸不利。故本病應(yīng)以補(bǔ)腎強(qiáng)督，祛風(fēng)散寒為基本治則。另外瘀血貫穿疾病始終，疼痛夜甚是其重要表現(xiàn)，夜間陽(yáng)氣入陰，氣不行血，致血行不暢，不通則痛，故治療的同時(shí)應(yīng)注意活血化瘀藥的配伍。壯督驅(qū)寒合劑由我們臨床治療AS的經(jīng)驗(yàn)方化裁而成，方中狗脊苦甘溫，苦能燥濕，甘能益血，溫能養(yǎng)氣，善補(bǔ)肝腎，強(qiáng)腰脊，祛風(fēng)濕，是補(bǔ)而能走之藥，《神農(nóng)本草經(jīng)》曰其：“主腰背強(qiáng)，機(jī)關(guān)緩急，周痹寒濕，膝痛”為君藥。杜仲甘溫，入肝腎經(jīng)，助狗脊補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨；獨(dú)活祛風(fēng)除濕，通痹止痛；蒼術(shù)合白術(shù)燥濕健脾；乳香合沒(méi)藥行氣活血；桂枝則取其溫通經(jīng)脈，調(diào)和營(yíng)衛(wèi)之效；麻黃性溫，合白術(shù)能除濕通絡(luò)止痛，白術(shù)又可佐制麻黃發(fā)汗太過(guò)之弊；甘草通經(jīng)脈，利血?dú)?，調(diào)和諸藥，全方共奏補(bǔ)腎壯督，祛寒除濕，活血通絡(luò)之效。

本研究通過(guò)復(fù)制AS小鼠進(jìn)行藥物干預(yù)，通過(guò)免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用壯督驅(qū)寒合劑的AS小鼠DKK-1蛋白表達(dá)較模型組增加，β-catenin蛋白表達(dá)較模型組減少，提示壯督驅(qū)寒合劑抑制AS新骨形成的機(jī)制可能與Wnt/β-cateni信號(hào)通路相關(guān)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，壯督驅(qū)寒合劑可下調(diào)AS小鼠中mi-R29a、β-catenin mRNA的表達(dá)，上調(diào)DKK-1 mRNA的表達(dá)，說(shuō)明壯督驅(qū)寒合劑可能通過(guò)miR-29a來(lái)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活，從而起到延緩AS的新骨形成的作用。同時(shí)結(jié)果顯示中藥高劑量組對(duì)mi-R29a及Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響優(yōu)于中藥低劑量組及西藥組，表明壯督驅(qū)寒合劑對(duì)AS小鼠新骨形成的抑制作用存在一定的量效關(guān)系，后續(xù)我們將設(shè)置不同藥物濃度的組別，進(jìn)行在體和離體實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步觀察壯督驅(qū)寒合劑對(duì)miR-29a、Wnt/β-catenin信號(hào)通路及其上下游更多細(xì)胞因子的影響，以便更好的闡釋壯督驅(qū)寒合劑治療AS的藥物機(jī)理。