川芎嗪通過激活PKCα/Nrf2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制七氟烷誘導(dǎo)的氧化損傷和血腦屏障破壞研究*

鄭思敏,張少博,牛曉麗,劉鴻濤,熊虹飛,張會(huì)娟

西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科(西安 710004)

每年有數(shù)百萬名產(chǎn)婦和新生兒在分娩或外科手術(shù)中接受麻醉，而七氟烷(Sevoflurane)由于其安全性，起效快，恢復(fù)快等優(yōu)點(diǎn)而成為最常見的吸入麻醉藥之一[1-2]，但是七氟烷會(huì)損害海馬，并通過神經(jīng)元凋亡，神經(jīng)炎癥和線粒體功能障礙等誘發(fā)海馬依賴性學(xué)習(xí)和記憶障礙[3-4]。核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2在調(diào)節(jié)抗氧化因子產(chǎn)生，維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)方面起著重要作用，通過抑制蛋白激酶Cα(PKCα)/Nrf2信號通路可以降低Nrf2表達(dá)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[5]，并可抑制電磁脈沖誘導(dǎo)的ZO-1(小帶閉合蛋白1)易位，從而保護(hù)血腦屏障(Blood brain barrier，BBB)生理結(jié)構(gòu)[6]。

川芎嗪(Ligustrazine)是一種傳統(tǒng)中藥，是中藥川芎的主要有效成分，可通過刺激抗氧化酶表達(dá)來抑制氧化應(yīng)激，研究指出，川芎嗪可以通過增加Nrf2的表達(dá)增強(qiáng)抗氧化酶基因，例如血紅素加氧酶-1(HO-1)的表達(dá)，進(jìn)而降低氧化應(yīng)激，治療小鼠神經(jīng)炎癥[7-8]。然而，川芎嗪對于七氟烷誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激以及BBB通透性異常增加的影響，尚未見詳細(xì)報(bào)道。

材料與方法

1 動(dòng) 物 30只懷孕的Wistar雌性大鼠購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于45%～55%濕度，22±1 ℃溫度的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房中，在12 h的明暗循環(huán)中，自由飲食飲水，實(shí)驗(yàn)共使用100只新生幼鼠，體重16～28 g，1周齡。該研究得到西安交通大學(xué)動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)的批準(zhǔn)。

2 麻醉處理 將48只幼鼠(n=12/組)隨機(jī)分為四組：對照組，大鼠吸入30%O23 h；七氟烷組，大鼠暴露于1.5%七氟烷和30%O2的環(huán)境中作用3 h；七氟烷加川芎嗪組(川芎嗪組)，在吸入七氟烷之前15 min，對幼鼠腹膜內(nèi)給予川芎嗪(10 mg/kg，溶解在1%的乙醇溶液中)；七氟烷加溶劑組(溶劑組)，在吸入七氟烷之前，用等體積的1%乙醇處理大鼠。

3 組織樣本制備 吸入七氟烷后，在0.5、1、3 h以及6 h時(shí)分別頸椎脫臼法處死每組中的6只小鼠，在無菌環(huán)境下分離大腦；吸入七氟烷后3 h，頸椎脫臼法處死每組剩余6只小鼠，在無菌環(huán)境下分離海馬，將海馬和大腦并固定在10%福爾馬林中，以進(jìn)行蘇木精和曙紅(HE)，免疫組織化學(xué)(IHC)和免疫熒光(IF)。每組幼鼠三個(gè)海馬分別使用0.5%的預(yù)冷的戊二醛，4%的預(yù)冷的低聚甲醛和0.1 mmol/L磷酸鹽緩沖液洗滌，然后將海馬組織浸入含2.5 %戊二醛的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液中，以進(jìn)行透射電子顯微鏡檢查。將每組幼鼠的六個(gè)海馬存放于-80℃冰箱，其余部分海馬用于測量ROS，超氧化物歧化酶，丙二醛和谷胱甘肽。

4 ROS，SOD，MDA，GSH和S100β的測量 收獲海馬和大腦后，通過使用組織均質(zhì)器(碧云天試劑公司，中國)在裂解緩沖液中均質(zhì)化，1000 r離心10 min，收集上清液，按照試劑商說明，使用ELISA試劑盒測量ROS，SOD，MDA，GSH和S100β濃度，所用試劑盒均購自百奧萊博公司(中國)。

5 組織病理學(xué)觀察 固定海馬體后，以分級乙醇系列進(jìn)行樣品脫水，然后將樣品包埋在石蠟中，用切片機(jī)將石蠟包埋的海馬組織切成5 μm切片，然后用HE染色，在顯微鏡(奧林巴斯，日本)上觀察切片，并進(jìn)行圖像捕獲。準(zhǔn)備用于透射電子顯微鏡檢查的海馬切片以梯度乙醇脫水，將超薄切片(40～60 nm)固定在200目金屬網(wǎng)格上，并用乙酸鈾酰和檸檬酸鉛染色，使用H-7650電子顯微鏡(CST，美國)觀察切片。

6 蛋白質(zhì)印跡分析 SDS-PAGE分離樣品(30 μg蛋白)并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，與抗Nrf2一抗 (1∶500，CST，美國)，抗PKCα(1∶1000，CST，美國)，抗HO-1(1∶2000，Beyotime Biotechnology，中國)，抗PCNA(1∶500，Beyotime Biotechnology，中國)和抗β-肌動(dòng)蛋白(1∶500，Beyotime Biotechnology，中國)，抗ZO-1(1∶1000，CST，美國)，室溫孵育過夜后，與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的山羊抗兔IgG抗體(1∶6000，ZSGB-BIO，美國)室溫孵育2 h。使用ECL Western Blot檢測系統(tǒng)(Thermo Scientific，美國)將蛋白質(zhì)條帶可視化。以β-肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參進(jìn)行蛋白表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化，蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

7 免疫組織化學(xué)染色和免疫熒光 IHC：處理大腦切片和海馬切片以暴露表面抗原，然后與MMP-2(1∶100，CST，美國)，MMP-9(1∶100，CST，美國)，TIMP-1(1∶100，CST，美國)，TIMP-2(1∶100，CST，美國)，HO-1一抗(1∶100，Eyotime Biotechnology，中國)特異性一抗中室溫下孵育2 h，將切片依次與生物素化的連接二抗和過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素各孵育1 h，洗滌后與發(fā)色二氨基聯(lián)苯胺-四鹽酸鹽(DAB)底物一起孵育，然后在蘇木精中復(fù)染，使用奧林巴斯顯微鏡檢查染色的切片。

IF：暴露切片表面抗原后，在室溫下與山羊血清一起孵育4 h，與Nrf2一抗(1∶100，CST，美國)在封閉溶液中于4 ℃孵育過夜，預(yù)冷的PBS洗滌3次，與CY3標(biāo)記的抗兔IgG (1∶300，Goodbio Technology，中國)，然后使用Nikon Eclipse Ni倒置顯微鏡(Nikon，日本)采集圖像。

8 原位酶譜 將腦冷凍切片快速干燥，并用含1%(w/v)瓊脂糖，0.1 mg/ml熒光素偶聯(lián)DQ明膠(R&D，美國)的PBS溶液覆蓋，覆蓋2 h后將切片在黑暗中于反應(yīng)溶液(0.05 mol/L Tris-HCl，0.15 mol/L NaCl，5 mmol/L CaCl2，0.2 mmol/L NaN3)中室溫孵育24 h，使用熒光顯微鏡2000(Nikon TE，日本)記錄圖像。

9 逆轉(zhuǎn)錄PCR 根據(jù)制造商的說明，使用Trizol試劑(海派醫(yī)藥，中國)從大鼠大腦皮層中分離總RNA，通過分光光度法評估RNA的純度，通過RT-PCR和特異性引物檢查TJ蛋白ZO-1的RNA表達(dá)，肌動(dòng)蛋白用作上樣對照。在42 ℃下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄60 min，然后加熱至95 ℃5 min。使用如下的特異性引物進(jìn)一步擴(kuò)增反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的等分試樣：ZO-1正向引物5’-TGTGAGTCCTTCAGCTGTGGA-3’，ZO-1反向引物5’-GGAACTCAACACACCACCATT-3’。肌動(dòng)蛋白正向引物5’-CAAGGCCAACCGTGAGAA-3’，肌動(dòng)蛋白反向引物5’-AGGCATACAGGGACAGCACA-3’，將PCR加熱至94 ℃持續(xù)5 min，30次循環(huán)，分別于94 ℃持續(xù)45 s，60 ℃持續(xù)45 s，72 ℃持續(xù)1 min。

10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。通過單向方差分析(ANOVA)分析數(shù)據(jù)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，使用GraphPad Prism 7(GraphPad，美國軟件)進(jìn)行圖形繪制。

結(jié) 果

1 川芎嗪減少七氟烷引起的病理損傷 HE染色結(jié)果表明，對照組的結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)元細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞表觀分級，神經(jīng)元細(xì)胞表現(xiàn)出廣泛的細(xì)胞質(zhì)，而細(xì)胞核表現(xiàn)為藍(lán)色和圓形，核膜完整，核仁清晰；與對照組相比，七氟烷組神經(jīng)元細(xì)胞明顯減少，大多數(shù)神經(jīng)元細(xì)胞胞質(zhì)明顯縮小，細(xì)胞間空隙明顯增加，部分神經(jīng)元細(xì)胞核仁消失，細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生變化；與七氟烷組相比，川芎嗪組的細(xì)胞損傷明顯減輕，海馬神經(jīng)元呈規(guī)則排列，僅觀察到少數(shù)細(xì)胞核表現(xiàn)為融合性，細(xì)胞間間隙明顯降低；在溶劑組中，細(xì)胞損傷與七氟烷組相似(圖1)。

注：黑色箭頭表示壞死的神經(jīng)元；白色箭頭指示增加的細(xì)胞間隙

透射電鏡檢查的結(jié)果顯示，對照組的神經(jīng)元細(xì)胞核膜清晰可見，形態(tài)正常，細(xì)胞器豐富，線粒體密集，線粒體膜完整且完整；七氟烷組和溶劑組中，核膜完整性被破壞并且觀察到細(xì)胞質(zhì)空泡化。此外，線粒體結(jié)構(gòu)破壞，部分線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)被破壞，高爾基體腔擴(kuò)大；與對照組相比，在川芎嗪組神經(jīng)元細(xì)胞沒有表現(xiàn)出明顯的變化，核膜完好，線粒體形態(tài)正常，只有單個(gè)線粒體出現(xiàn)斷裂(圖2)。

注：黑色箭頭表示線粒體破裂；白色箭頭表示核膜不完整

2 七氟烷增加小鼠MMP-2，MMP-9的表達(dá) 見表1(圖3)。與對照組相比，七氟烷暴露后的MMP-2蛋白和MMP-9蛋白水平均有明顯地增加，微血管內(nèi)皮細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的免疫染色出現(xiàn)明顯增加；此外，對照組和七氟烷組的微血管內(nèi)皮細(xì)胞均未檢測到TIMP-2的免疫染色，TIMP-1的免疫染色也無明顯差異。

A：七氟烷暴露后3 h后微血管內(nèi)皮細(xì)胞中MMP-2的免疫染色增加；B：在對照組和七氟烷組的微血管內(nèi)皮細(xì)胞中未檢測到TIMP-2的免疫染色；C：七氟烷暴露3 h后，微血管內(nèi)皮細(xì)胞中MMP-9的免疫染色增加；D：在對照組和七氟烷組之間，微血管內(nèi)皮細(xì)胞中TIMP-1的免疫染色無明顯變化

表1 兩組小鼠大腦皮層中MMP-2，MMP-9蛋白質(zhì)相對表達(dá)水平

3 川芎嗪抑制七氟烷誘導(dǎo)的明膠分解活性并抑制BBB通透性的增加 見表2(圖4)。與對照組相比，暴露于七氟烷3 h后，腦微血管中的明膠分解活性顯著增加，ZO-1表達(dá)顯著下調(diào)，而S100β水平明顯升高；與七氟烷組或溶劑組小鼠相比，川芎嗪處理后，明膠分解活性的增加被明顯抑制，ZO-1表達(dá)被明顯上調(diào)，七氟烷誘導(dǎo)的S100β外滲則顯著減弱。

圖4 川芎嗪抑制七氟烷誘導(dǎo)的明膠分解活性的增加(比例尺=20 μm)

表2 各組小鼠的ZO-1和S100β的相對水平

4 川芎嗪減輕七氟烷誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激 見表3。與對照組相比，七氟烷組和溶劑組小鼠ROS水平顯著增加，BMD水平顯著升高，SOD和GSH的活性顯著降低；與七氟烷組或溶劑組小鼠相比，川芎嗪組小鼠的ROS和BMD水平明顯降低，SOD和GSH的活性顯著升高。

表3 各組小鼠氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白的相對表達(dá)水平

5 川芎嗪激活 PKCα/Nrf2 通路以減少七氟烷引起的海馬損傷 見表4(圖5)。與對照組相比，七氟烷組和溶劑組中PKCα，Nrf2和HO-1的表達(dá)顯著降低；與七氟烷組或溶劑組相比，川芎嗪組細(xì)胞中PKCα和HO-1的表達(dá)顯著升高，且細(xì)胞核中Nrf2的水平顯著增加。

注：Nrf2抗體以紅色顯示，核染色由藍(lán)色的4，6-二mid基-2苯基吲哚(DAPI)表示，合并的藍(lán)色和紅色染色表示Nrf2的核定位

表4 各組小鼠PKCα/Nrf2通路相關(guān)蛋白的相對表達(dá)水平

討 論

在4歲之前接受全身麻醉的兒童會(huì)通過抑制神經(jīng)發(fā)育而引起長期神經(jīng)認(rèn)知損害，增加學(xué)習(xí)和記憶障礙風(fēng)險(xiǎn)[9-10]。最新的研究表明，氧化應(yīng)激以及BBB通透性的異常增加是全身麻醉誘導(dǎo)的認(rèn)知缺陷的關(guān)鍵[11]。然而，目前臨床上缺乏有效的神經(jīng)保護(hù)劑以防止氧化損傷改善血腦屏障通透性。傳統(tǒng)中醫(yī)理論以“正氣存內(nèi)而外邪不可干”為中心，講究通過調(diào)整患者的內(nèi)環(huán)境以減輕手術(shù)麻醉所引起的損傷，緩解西藥麻醉誘發(fā)的氣血傷害。川芎嗪是一種傳統(tǒng)中藥，是從傘形科藁本屬植物川芎中分離提純的生物堿單體,是中藥川芎的主要有效成分，具有補(bǔ)氣益血，平補(bǔ)陰陽，補(bǔ)肝行血的效果，進(jìn)而讓患者的臟腑功能得到恢復(fù)，發(fā)揮廣泛的神經(jīng)保護(hù)作用。最近的研究報(bào)道全身麻醉相關(guān)的神經(jīng)毒性對發(fā)育中的大腦的影響，包括氧化應(yīng)激，不成對的突觸形成，甚至是長期的行為缺陷，而腹腔內(nèi)注射劑量為10 mg/kg的川芎嗪可起到神經(jīng)保護(hù)劑的作用[12]。在本研究中，川芎嗪治療可有效恢復(fù)七氟烷導(dǎo)致的海馬損傷大鼠海馬結(jié)構(gòu)和功能的損傷，恢復(fù)大腦皮層BBB的生理狀態(tài)。先前的研究證實(shí)，在1.5%的七氟烷中暴露3 h會(huì)誘發(fā)認(rèn)知缺陷[13]。我們的結(jié)果表明暴露于1.5%的七氟烷中暴露3 h會(huì)導(dǎo)致大鼠線粒體形態(tài)發(fā)生顯著改變，而川芎嗪治療可減輕病理改變，表明川芎嗪在預(yù)防和治療七氟烷引起的海馬損傷的臨床應(yīng)用中的潛在價(jià)值。

在哺乳動(dòng)物大腦發(fā)育過程中，氧化應(yīng)激在常用麻醉劑引起的神經(jīng)元變性中起重要作用。一些研究指出七氟烷可以在血液中產(chǎn)生不同濃度的三氟乙酸，從而增加ROS的積累并抑制抗氧化酶例如SOD，GSH和MDA的表達(dá)，增加自由基濃度以及氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性[14]。在我們的研究中，氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的結(jié)果表明，暴露于1.5%的七氟烷3 h會(huì)引起海馬組織的氧化應(yīng)激，而川芎嗪顯著降低ROS和MDA的水平，并明顯增加SOD和GSH的活性。表明川芎嗪可以通過上調(diào)抗氧化酶的表達(dá)來清除活性氧，減輕神經(jīng)元細(xì)胞的病理損傷，從而保護(hù)海馬，證明川芎嗪具有緩解七氟烷引起的海馬氧化應(yīng)激的能力。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是鋅依賴性內(nèi)肽酶家族，可以在氧化應(yīng)激條件下被異常激活，從而降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)成分，而MMP受金屬蛋白酶的特定內(nèi)源性組織抑制劑(包括TIMP-1，TIMP-2，TIMP-3和TIMP-4)嚴(yán)格調(diào)節(jié)。研究指出MMP-2和MMP-9可在麻醉?xiàng)l件下被誘導(dǎo)增加，并通過介導(dǎo)的ZO-1的降解破壞BBB[15]，并表現(xiàn)為BBB開放血清標(biāo)志物S100β的顯著增加。在本研究中，蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果表明七氟烷處理對TIMP-1，TIMP-2的活性無明顯影響，但能明顯增加MMP-2和MMP-9的表達(dá)，從而誘導(dǎo)ZO-1的降解，并變現(xiàn)為S100β水平的明顯增加，提示七氟烷處理能夠以非TIMP依賴的方式上調(diào)MMP-2和MMP-9水平，導(dǎo)致BBB功能的損傷。

據(jù)報(bào)道，PKC信號通路與海馬中麻醉相關(guān)的神經(jīng)變性抑制以及BBB通透性異常改變密切相關(guān)。血腦屏障(BBB)是高度分化的結(jié)構(gòu)，由緊密連接的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞單層構(gòu)成，并通過緊密連接(TJ)以及輔助蛋白(ZO)連接在連接復(fù)合體上，可以有效地阻止大分子及有毒物質(zhì)的滲透[16-19]。研究指出，PKC抑制可以上調(diào)明膠酶表達(dá)，從而誘導(dǎo)BBB正常功能狀態(tài)敏感性指標(biāo)ZO-1蛋白的降解增加，導(dǎo)致BBB通透性的改變[20-21]；此外，PKC激活可以磷酸化Nrf2，使Nrf2與Keap1分離，導(dǎo)致其易位至細(xì)胞核，誘導(dǎo)HO-1和其他抗氧化酶例如SOD和GSH的表達(dá)并防止氧化應(yīng)激[22-24]；在本研究中，蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果表明川芎嗪可以激活PKCα/Nrf2信號通路發(fā)揮抗氧化作用，并通過抑制明膠酶介導(dǎo)的ZO-1的降解，增加ZO-1蛋白的表達(dá)，改善BBB的功能狀態(tài)；而IHC和IF的結(jié)果表明，川芎嗪顯著增加核Nrf2表達(dá)，并誘導(dǎo)HO-1過表達(dá)，表明川芎嗪可以激活PKCα/Nrf2信號通路，促進(jìn)Nrf2的核轉(zhuǎn)運(yùn)，并誘導(dǎo)Nrf2下游的抗氧化酶HO-1的表達(dá)，從而減少七氟烷引起的氧化應(yīng)激和隨后的海馬損傷。此外，雖然我們的數(shù)據(jù)表明在一定程度上七氟烷可以激活PKCα/Nrf2信號通路，但是SOD和GSH等下游因素并未得到明顯改善?？赡苁且?yàn)槁樽頃?huì)破壞體內(nèi)氧化和抗氧化的平衡，而氧化應(yīng)激與保護(hù)機(jī)制之間的平衡是通過復(fù)雜的細(xì)胞生理學(xué)維持的，平衡障礙時(shí)則會(huì)導(dǎo)致氧化還原穩(wěn)態(tài)異常并產(chǎn)生病理損傷。

總之，我們的結(jié)果表明，七氟烷可通過海馬組織中的氧化應(yīng)激引起損傷，并通過MMP-2和MMP-9的表達(dá)以及明膠酶活性增加誘導(dǎo)ZO-1的降解，破壞BBB功能狀態(tài)，而川芎嗪可以通過激活PKCα/Nrf2信號通路，抑制明膠酶活性，增加ZO-1的表達(dá)，改善BBB通透性，并通過誘導(dǎo)抗氧化酶的表達(dá)，進(jìn)而降低海馬體的氧化應(yīng)激，有效地保護(hù)海馬免受氧化應(yīng)激的傷害，改善海馬體組織病理學(xué)結(jié)構(gòu)。