環(huán)孢素A聯(lián)合抗真菌藥物體外抗茄病鐮刀菌效果研究

陳曉蓮，楊鎮(zhèn)朵，丁 輝，何 宏，吳嬌嬋，胡獻(xiàn)鋁，鐘興武

0引言

真菌性角膜炎在以農(nóng)業(yè)為主的發(fā)展中國家是重要的致盲性眼病，因缺乏有效的治療藥物而增加其嚴(yán)重性與危險性。在我國真菌性角膜炎的主要致病菌是鐮刀菌[1-2]，海南省地處熱帶地區(qū)，氣候常年潮濕溫?zé)?，真菌性角膜炎的發(fā)生率高，主要致病菌以鐮刀菌為主[3-4]。鐮刀菌的體外抗真菌研究顯示其對臨床常用的傳統(tǒng)唑類藥物耐藥[1]，使真菌性角膜潰瘍的治療難度增加。

抗真菌藥物的創(chuàng)新成為真菌性角膜炎治療的關(guān)鍵，聯(lián)合用藥提高現(xiàn)有抗真菌藥物的治療價值將為真菌性角膜炎的治療帶來曙光。臨床上，器官移植患者在接受免疫抑制劑治療的同時為避免真菌感染常同時聯(lián)合使用抗真菌藥物，取得良好治療作用的同時亦觀察到其間存在相互作用[5]。免疫抑制劑環(huán)孢素A在眼科已廣泛應(yīng)用于角膜移植術(shù)后抗排斥和干眼癥的治療，而環(huán)孢素A聯(lián)合抗真菌藥物對真菌性角膜炎分離菌株的藥物敏感性影響鮮見報道。本文對環(huán)孢素A與多種抗真菌藥物聯(lián)合應(yīng)用的體外抗真菌效果進(jìn)行報道。

1對象和方法

1.1對象實驗菌株培養(yǎng)與鑒定：本研究22株茄病鐮刀菌均取自海南省眼科醫(yī)院確診真菌性角膜潰瘍患者角膜刮片取材分離菌株。所用菌株均通過檢驗科真菌實驗室的真菌學(xué)標(biāo)準(zhǔn)鑒定為茄病鐮刀菌菌種。實驗前所有菌株均在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)斜面35℃培養(yǎng)48～72h，其后在28℃繼續(xù)培養(yǎng)至7d。本研究所使用抗真菌藥物為伏立康唑(貨號：Y0001395)，那他霉素(貨號：P9703)，兩性霉素B(貨號：V900919)，氟康唑(貨號：F8929)和環(huán)孢素A(貨號：239835)均購自Sigma公司。除氟康唑用蒸餾水溶解外其余所有藥物均以分析純級DMSO溶解成儲存液，濃度為氟康唑5120μg/mL，其余4種藥物均為1600μg/mL。培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)、RPMI1640液體培養(yǎng)基。

1.2方法

1.2.1微量肉湯稀釋法評價抗真菌藥物單獨使用藥物敏感性參考CLSI M27-Ed4[6]及M38-Ed3[7]方案在96孔微型滴定板上進(jìn)行微量肉湯稀釋法。為選擇每種藥物對菌株不同敏感性的合適濃度范圍，對每個菌株進(jìn)行探索性研究并確定個體藥物的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentrations，MIC)。以RPMI1640液體培養(yǎng)基稀釋藥液使其成為2倍工作濃度，篩選伏立康唑、那他霉素、兩性霉素B、氟康唑和環(huán)孢素A的濃度應(yīng)用范圍，即最終濃度分別是伏立康唑32～0.06μg/mL，兩性霉素B 32～0.06μg/mL，那他霉素128～0.25μg/mL，氟康唑256～0.5μg/mL，環(huán)孢素A 256～0.5μg/mL。將各個藥物分別加在96孔板的A～D行每行的1～10列按照濃度從高到低加入稀釋好的藥液各100μL，同時設(shè)立生長對照(無藥物孔)和陰性對照(無菌孔)。

菌懸液制作：茄病鐮刀菌于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基35℃培養(yǎng)48～72h，再轉(zhuǎn)入28℃培養(yǎng)至7d。將菌轉(zhuǎn)入0.85%鹽水1mL中，滴入吐溫20去除菌絲片段，靜置3～5min取上清液轉(zhuǎn)移至無菌管，震蕩15s。用光線路徑1cm比色杯測530nm光密度為0.15～0.17，用經(jīng)三氮嗎啡啉丙磺酸鈉(MOPS)緩沖(pH=7.0)的2%葡萄糖RPMI1640液體培養(yǎng)基進(jìn)行1∶50稀釋后得到工作菌液，達(dá)到最終要求濃度的2倍，致接種終濃度為(0.5～5)×104CFU/mL。加好藥液的96孔板上除陰性對照孔外其余各孔均加入100μL的2倍終濃度菌懸液，分別于35℃孵育48h。觀察判讀結(jié)果，根據(jù)中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(WS/T411-2013)《抗絲狀真菌藥物敏感性試驗肉湯稀釋法》中對于MIC結(jié)果判讀的標(biāo)準(zhǔn)方法要求，對鐮刀菌的最低抑菌濃度(MIC)終點判斷標(biāo)準(zhǔn)為：觀察到的與生長對照相比除氟康唑是50%抑制其余藥物100%抑制的最低藥物濃度為各藥物的MIC[8]。所有藥敏試驗均重復(fù)操作2遍。藥敏質(zhì)控菌株為ATCC22019。

1.2.2棋盤法評價體外聯(lián)合藥物敏感性采用棋盤法測試環(huán)孢素A與抗真菌藥物體外聯(lián)合藥物敏感性。在96孔板中分別加入環(huán)孢素A與不同濃度的1種抗真菌藥物。自左向右1～10列為聯(lián)合用藥區(qū)，每孔加入4倍終濃度的藥物倍比稀釋液各50μL；每板第1～10列分別為伏立康唑、那他霉素、兩性霉素B和氟康唑，藥物終濃度為伏立康唑16～0.03μg/mL，兩性霉素B 16～0.03μg/mL，那他霉素64～0.125μg/mL，氟康唑128～0.25μg/mL；第8～1行的1～10列分別加入環(huán)孢素A至終濃度為128～1μg/L，每行濃度一致，同時設(shè)立生長對照和空白對照。接種時除陰性對照孔外其余各孔均加入100μL的2倍終濃度菌懸液。于35℃靜置培養(yǎng)48h判定MIC結(jié)果。采用LA理論，將藥物單獨使用或兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用時，產(chǎn)生相同藥效的濃度(等效位點)進(jìn)行比較。部分抑菌濃度指數(shù)法分?jǐn)?shù)抑菌濃度指數(shù)(fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI)：FICI=CA/MICA+CB/MICB，其中 MICA為A藥單用時的MIC，MICB為B藥單用時的MIC，CA為兩藥聯(lián)用后得到同一抗菌結(jié)果時A藥的MIC，CB為兩藥聯(lián)用后得到同一抗菌結(jié)果時B藥的MIC。FICI值大于4表示兩藥有拮抗作用，F(xiàn)ICI值介于0.5和4之間表示兩藥相互作用為無關(guān)，F(xiàn)ICI≤0.5則表示兩藥有協(xié)同作用[9]。

統(tǒng)計學(xué)分析：利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料用例數(shù)和率[n(%)]表示，兩組差異比較采用卡方檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1菌株鑒定結(jié)果本研究培養(yǎng)所得22株鐮刀菌屬菌種鏡下可見透明分隔菌絲、分生孢子梗、瓶梗和大小分生孢子，大分生孢子粗壯、壁厚、光滑，呈鐮刀形至紡錘形，遠(yuǎn)端尖，有多個分隔，以3隔居多。小型分生孢子假頭狀著生、光滑、透明，橢圓形、卵圓形、長橢圓形、短臘腸形、逗點形等，通常0～1個隔。茄病鐮刀菌顯微鏡下形態(tài)特征，見圖1、2。

圖1 茄病鐮刀菌顯微鏡下形態(tài)特征，乳酸酚棉藍(lán)染色(大、小分生孢子、菌絲，×100)。

圖2 茄病鐮刀菌顯微鏡下形態(tài)特征，乳酸酚棉藍(lán)染色(大、小分生孢子，×400)。

2.2單獨及聯(lián)合用藥藥敏結(jié)果四種抗真菌藥物那他霉素、伏立康唑、兩性霉素B和氟康唑?qū)︾牭毒?22株)的MIC值范圍分別是2～8、1～8、1～8和8～512μg/mL。那他霉素、伏立康唑與環(huán)孢素A體外聯(lián)合用藥時，均對所有菌株均無協(xié)同效應(yīng)，無拮抗效應(yīng)(表1、2)。兩性霉素B與環(huán)孢素A聯(lián)合應(yīng)用時，對41%菌株(9/22)有協(xié)同效應(yīng)，對所有菌株無拮抗效應(yīng)(表3)。氟康唑與環(huán)孢素A聯(lián)合用藥時，對64%菌株(14/22)有協(xié)同效應(yīng)，無拮抗效應(yīng)(表4)。

表1 那他霉素單獨及聯(lián)合環(huán)孢素A對鐮刀菌體外抗真菌藥物敏感性

表2 伏立康唑單獨及聯(lián)合環(huán)孢素A對鐮刀菌體外抗真菌藥物敏感性

表3 兩性霉素單獨和聯(lián)合環(huán)孢素A對鐮刀菌體外抗真菌藥物敏感性

表4 氟康唑單獨和聯(lián)合環(huán)孢素A對鐮刀菌體外抗真菌藥物敏感性

單用抗真菌藥物時對菌株的藥物敏感率分別是那他霉素100%、伏立康唑31.8%、兩性霉素B 4.5%及氟康唑4.5%，聯(lián)合使用環(huán)孢素A后兩性霉素B的藥物敏感率提升至68.2%。如表5結(jié)果顯示，單獨使用及聯(lián)合使用環(huán)孢素A時，氟康唑、伏立康唑、那他霉素敏感率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。聯(lián)合使用環(huán)孢素A后鐮刀菌對兩性霉素B敏感率高于單獨使用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001),見圖3。

表5 抗真菌藥物單獨使用及聯(lián)合環(huán)孢素A對鐮刀菌藥物敏感性比較

圖3 抗真菌藥物單獨使用及聯(lián)合環(huán)孢素A對鐮刀菌藥物敏感性比較 aP<0.05 vs 單獨使用抗真菌藥物。

3討論

從我院臨床分離鐮刀菌株體外培養(yǎng)抗真菌藥物敏感性研究顯示，通過微量肉湯稀釋法觀察到鐮刀菌對那他霉素的敏感性最高，伏立康唑次之，氟康唑及兩性霉素B均表現(xiàn)為低敏感性，與王志昕等[10]、張陽等[11-12]對眼部真菌感染及藥物敏感性分析結(jié)果一致?？拐婢幬锇ㄟ蝾惣岸嘞╊?，唑類包括咪唑類及三唑類，前者以咪康唑為代表，后者包括氟康唑、伏立康唑及伊曲康唑等；多烯類抗真菌藥物主要包括那他霉素及兩性霉素B。有研究表明絲狀真菌感染所致的真菌性角膜炎對酮康唑、咪康唑、伊曲康唑及氟康唑的治療不敏感[13]，且鐮刀菌通常對傳統(tǒng)唑類藥物耐藥，因此在提高藥物敏感性的聯(lián)合用藥研究中免疫抑制劑的聯(lián)合應(yīng)用成為關(guān)注的熱點。Onyewu等[14]在白念珠菌感染的角膜炎小鼠模型中，聯(lián)合使用氟康唑和環(huán)孢素A的眼用制劑，顯示出了類似體內(nèi)藥物的協(xié)同作用，能有效地控制白念珠菌感染情況。

環(huán)孢素A是一種強效免疫抑制劑，由絲狀真菌茄病鐮刀菌和柱孢霉菌等霉菌的代謝產(chǎn)物中提取分離而得的，是一種含有11個氨基酸的環(huán)狀多肽，能夠通過抑制鈣調(diào)磷酸酶調(diào)控細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路從而抑制T細(xì)胞增殖。在眼科已廣泛應(yīng)用于干眼癥及角膜移植術(shù)后的治療，尤其是在真菌性角膜潰瘍角膜移植術(shù)后作為替代糖皮質(zhì)激素的局部藥物治療[15]。在抗真菌作用機制中，由于鈣調(diào)磷酸酶對維持微生物的應(yīng)激存活具有重要作用，因此環(huán)孢素A作為鈣調(diào)磷酸酶抑制劑，正逐漸被探索應(yīng)用于真菌感染的聯(lián)合用藥治療，達(dá)到抑制真菌的生長目的[16-17]。Bell等[18]在環(huán)孢素A的體外抑菌實驗中發(fā)現(xiàn)，對尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、茄病鐮刀菌(Fusarium solani)的菌落數(shù)量和煙曲霉菌(Aspergillus fumigatus)菌落大小的抑制呈明顯的劑量依賴性，表明環(huán)孢素A具有對真菌的抑制作用。 Shinde等[19]將氟康唑、伏立康唑、卡泊芬凈、兩性霉素、制霉菌素等五種抗真菌藥物與環(huán)孢素A的聯(lián)合作用，對白念珠菌進(jìn)行了體外試驗，結(jié)果不同抗真菌藥物與環(huán)孢素A聯(lián)合后對白念珠菌的MIC均降低2～16倍，提示環(huán)孢素A能有效提高抗真菌藥對白念珠菌的敏感性。除白念珠菌外，環(huán)孢素A與抗真菌藥物聯(lián)合應(yīng)用對曲霉菌、新生隱球菌也可產(chǎn)生協(xié)同作用[20]。Mo等[21]研究證實環(huán)孢素A與氟康唑聯(lián)合使用對馬爾尼菲青霉菌的抗真菌作用具有協(xié)同效應(yīng)。針對與以往研究中菌株的來源不同及聯(lián)合用藥的差異比較，本研究結(jié)果中也顯示，對臨床標(biāo)本分離鐮刀菌環(huán)孢素A與氟康唑聯(lián)合應(yīng)用對64%菌株有協(xié)同效應(yīng)，與兩性霉素B聯(lián)合應(yīng)用對41%菌株有協(xié)同效應(yīng)，且所有菌株無拮抗效應(yīng)產(chǎn)生，證實在鐮刀菌屬環(huán)孢素A與抗真菌藥物的協(xié)同作用。

值得關(guān)注的是，協(xié)同效應(yīng)的產(chǎn)生與藥物敏感性的提升可能并不是同步的。本研究中單獨使用抗真菌藥物時菌株對氟康唑和兩性霉素B的藥物敏感率僅為4.5%，伏立康唑的藥物敏感率為31.8%，那他霉素的敏感性最高為100%敏感，表明本研究所用菌株即使對同類型的不用藥物敏感性也存在很大差異。聯(lián)合使用環(huán)孢素A后，兩性霉素B聯(lián)合用藥對41%的菌株產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)并且藥物敏感性大幅提升；而伏立康唑、那他霉素與環(huán)孢素A的聯(lián)合用藥并未產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，藥物敏感性也未產(chǎn)生變化；值得注意的是氟康唑在與環(huán)孢素A聯(lián)合使用后對64%的菌株產(chǎn)生了協(xié)同效應(yīng)，然而藥物敏感性卻并未發(fā)生改變，仍表現(xiàn)出很高的耐藥率，即環(huán)孢素A的協(xié)同效應(yīng)主要發(fā)生在單獨用藥時敏感率低的抗菌藥物及氟康唑和兩性霉素B，但是環(huán)孢素A可能一定程度的提高了氟康唑?qū)甑囊志饔玫⒉荒茱@著提高其對藥物的敏感性，從而降低了氟康唑聯(lián)合用藥的有效性。對于協(xié)同效應(yīng)與藥物敏感性改變的不同步性進(jìn)行分析，可能的原因如下：首先，菌株的耐藥性不同可能與種屬差異相關(guān)。鐮刀菌屬有多種基因型，根據(jù)傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定將其分為16個組、65個種、55個變種和22個型，不同基因型的鐮刀菌對于抗真菌藥物的敏感性不同[22]。Rosa等[23]將患有惡性白血病并發(fā)鐮刀菌感染的菌株進(jìn)行分離并進(jìn)行了抗真菌藥敏感性研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在這種情況下存在著抗真菌藥物敏感性的物種及菌株特異性差異。其中以茄病鐮刀菌復(fù)合體(Fusarium solani species complex，F(xiàn)SSC)更為常見，其次為尖孢鐮刀菌復(fù)合體(Fusarium oxysporum species complex，F(xiàn)OSC)，然而臨床分離的茄病鐮刀菌復(fù)合體(FSSC)相較于尖孢鐮刀菌復(fù)合體(FOSC)對兩性霉素B和伏立康唑的耐藥性明顯增加。本研究中所用菌株為臨床病例標(biāo)本分離菌株，未對其進(jìn)行明確的基因分型，因此在藥物敏感性分析中可能存在針對不同基因型的藥物敏感性差異表現(xiàn)。針對此結(jié)果可在進(jìn)一步的研究中分析基因型特異性的藥物敏感性差異表現(xiàn)。此外，菌株的耐藥性差異可能也同時導(dǎo)致了同類型不同藥物、不同類型藥物間存在著協(xié)同效應(yīng)與藥物敏感性的差異。Li等[24]對環(huán)孢素A聯(lián)合三種唑類抗真菌藥氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑?qū)蝾惷舾邪啄钪榫斑蝾惸退幇啄钪榫乃幬锩舾行宰饔眠M(jìn)行了研究，結(jié)果表明環(huán)孢素A與唑類藥物聯(lián)合使用可表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)，尤其是對唑類耐藥的白念珠菌菌株協(xié)同效應(yīng)更顯著。同時，就唑類藥物的自身屬性而言，藥物活性與多烯類藥物存在明顯差異。相較于在高濃度時具有殺菌屬性的咪唑類(imidazoles)抗真菌藥物，同屬于三唑類(triazoles)的氟康唑及伏立康唑在抗真菌作用上則更多的表現(xiàn)為抑菌屬性[25]。唑類抗真菌藥物對14-α-去甲基化酶親和力的區(qū)別決定了在此類藥物中不同藥物間不同的抗真菌能力和活性譜[26]。伏立康唑作為第二代合成三唑類抗真菌藥物，與傳統(tǒng)的唑類藥物相比抗菌譜廣、活性強，但研究顯示藥物活性仍為抑菌屬性為主。而抑菌屬性的發(fā)揮可能較殺菌性能在臨床治療效應(yīng)中存在一定的限制，本研究結(jié)果顯示單獨使用抗真菌藥物時伏立康唑相較于氟康唑表現(xiàn)出明顯高的藥物敏感性，然而均不能產(chǎn)生有效的治療價值，對臨床效益價值的評估有重要意義。

綜上所述，對鐮刀菌感染所致的真菌性角膜炎首選那他霉素治療。環(huán)孢素A聯(lián)合應(yīng)用抗真菌藥物時，可與氟康唑和兩性霉素B對鐮刀菌產(chǎn)生協(xié)同作用，并且顯著提升兩性霉素B的藥物敏感性，具有重要的臨床意義。本研究進(jìn)一步豐富了環(huán)孢素A在抗真菌治療中的研究結(jié)果，能更好的為臨床治療提供參考，但因藥物作用的效果受諸多因素影響，體外實驗不能完全模擬體內(nèi)環(huán)境，加上臨床個體之間的差異，關(guān)于環(huán)孢素A的聯(lián)合用藥實際應(yīng)用療效分析以及機制研究還需進(jìn)一步研究并通過在體動物實驗等獲得更好的治療方法。