5種野生堇菜屬植物種子生物學特性研究

蔡 慧，丁彥芬*，董麗娜，楊甲樂，趙美婷

(1.南京林業(yè)大學 風景園林學院，江蘇 南京 210037； 2. 中山陵園管理局，江蘇 南京 210014)

野生花卉指現在仍在原產地處于天然自生狀態(tài)待開發(fā)利用的觀賞植物，不僅是地方天然風景和植被的重要組成部分，也是培育花卉新品種重要的種質資源和原始資料[1]。中國享有“世界園林之母”和“世界花卉寶庫”的美稱，野生花卉資源非常豐富[2]。據統計，全世界觀賞植物約3萬種，我國原產觀賞植物有1～2萬種，較常用的僅約2000種[3]。采用鄉(xiāng)土野生花卉資源進行引種栽培，其抗逆性強，節(jié)省后期的維護管理，可以真正做到節(jié)約園林成本又能增加生物多樣性。然而，目前對野生地被花卉的生態(tài)性研究及引種馴化方面的研究還相對較少。

堇菜屬(ViolaL.)植物種質資源豐富，約500余種，廣布熱帶、亞熱帶及溫帶，主要分布于北半球的溫帶地區(qū)[4]。堇菜屬植物開花早、綠期長，在我國分布廣、種類多、對當地環(huán)境適應性強、多數為多年生、一次種植可多年觀賞[5]。同時，本屬大多數種類在我國南方地區(qū)3～5月開花，花形美觀，是城市園林綠化的重要草種資源，可彌補我國南方地區(qū)早春露地花卉及其應用方面的不足[6]；堇菜屬植物還具有較高的藥用價值，具有止痛消炎、清熱解毒、抗氧化、抗免疫缺陷等藥理作用[7-8]。然而目前對該屬的研究較局限，在園林應用方面研究較少。堇菜屬植物多數處于野生狀態(tài)，因其較高的藥用價值，造成過度采挖，導致野生堇菜屬植物資源逐漸減少，因此亟需人工馴化栽培。堇菜屬植物以種子繁殖為主，結實多，但對于堇菜屬植物種子生物學特性及萌發(fā)條件缺乏系統的研究[9]。

本文以具有地域景觀特色的堇菜屬植物——采自南京市紫金山的早開堇菜(Violaprionantha)、犁頭草(Violajaponica)、戟葉堇菜(Violabetonicifolia)、長萼堇菜(Violainconspicua)和紫花堇菜(Violagrypoceras)5種野生堇菜屬植物種子為試驗材料，對其生物學特性及萌發(fā)條件進行研究，通過體視顯微鏡及電鏡對種子形態(tài)及種皮微細胞結構進行觀察，測定種子千粒重、吸水性、種子生活力等指標，研究不同處理下5種野生堇菜屬植物種子的萌發(fā)情況，以期為堇菜屬植物遺傳育種及分類提供依據，促進中國野生堇菜屬植物資源的開發(fā)利用，加快其引種馴化進程，為中國野生堇菜屬植物的種質資源保護、種子擴繁、園林應用等提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗種子于2019年5月采集于南京市紫金山(118°51′36" E，32°3′9" N)，放置于室內通風處，使其種子自然彈射出種皮，選擇顆粒飽滿種子為供試種子。

1.2 種子生物學特性測定

1.2.1 種子的形態(tài)特征及千粒重測定

利用體視顯微鏡分別對5種植物種子長、寬進行測量，并通過掃描電鏡觀察種子形態(tài)特征。采用百粒法，從每種植物的種子樣品中隨機取出100粒種子，用1/10000分析天平(ME204-02，梅特勒-托利多)稱重，重復8次，最后換算成千粒重[10]。

1.2.2 種子吸水率的測定

各種植物的種子材料取完整、劃開種皮和去除種皮的種子各30粒，置于10 mL離心管中，加蒸餾水8 mL，每種處理重復3次。放于恒溫25℃條件下，每隔2 h取出用吸水紙吸干表面水分后稱重，12 h后每12 h取出稱重，直到重量不變?yōu)橹?，最后計算種子吸水率。

種子吸水率(%)=(Wt-W0)/W×100

式中，Wt為吸水一定時間后種子的重量，W0為種子初始重量。

1.2.3 種子生活力的測定

于2019年6月和2019年12月，分別測定種子生活力。使用濃度為0.2%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC溶液)浸泡剛采集的以及經過室溫和低溫(4℃)儲存的5種植物的種子，每個處理 3 次重復，50 粒/重復。根據胚的染色程度和染色的深淺來鑒定種子的生活力。

種子生活力(%)=Vt/V0×100%

式中，Vt為染色或大部分染色種子數，V0為供試種子數。

1.3 種子發(fā)芽率測定

種子萌發(fā)試驗于2019年6月、2019年12月進行，在培養(yǎng)箱(RDN-400D-4，寧波東南儀器有限公司)內萌發(fā)。供試種子成熟、飽滿，未受昆蟲和病菌侵害，試驗前將種子統一預處理：1%次氯酸鈉浸泡5 min消毒，無菌水沖洗3次后，75%酒精消毒2次，沖洗干凈[11]。培養(yǎng)箱溫度設置為25℃，濕度80%，避光處理4 d，發(fā)芽后改為光照培養(yǎng)(2000LX)，每天光照12 h，黑暗12 h，以3 d種子萌發(fā)數不變?yōu)榘l(fā)芽截止時間，每天觀察記錄發(fā)芽的種子數[12-13]。

1.3.1 浸種試驗

2019年6月，隨機選取剛采集的5種植物的種子各300粒，預處理后，分為兩份，一份直接進行萌發(fā)試驗，一份25℃水浸種5 h后進行試驗。

1.3.2 儲存條件試驗

2019年12月，分別取室溫和4℃冰箱儲藏6個月的5種種子各150粒，預處理后，每組50粒，3次重復。

1.3.3 赤霉素處理試驗

試驗于2019年12月進行。供試種子為室溫儲存6個月的5種野生堇菜屬植物種子。取籽粒飽滿、經過預處理的5種種子在濃度為100、200、300、500、750 mg/L的赤霉素中浸泡種子4、8、12、24 h，分別以清水浸泡為對照。每組50粒，3次重復，置于培養(yǎng)箱中進行試驗。發(fā)芽期間，每天統計發(fā)芽數(胚芽突破種皮長度超過種子的一半為發(fā)芽)。

1.4 數據處理

采用Excel 2003和SPSS 24.0軟件對數據進行統計分析。采用單因素(one-way ANOVA)和Duncan法進行方差分析和多重比較(α=0.05)。利用Excel 2003和Origin 2017軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 堇菜屬植物種子生物學特性

2.1.1 種子外形及千粒重

利用體視顯微鏡對5種野生堇菜屬植物種子分別進行拍照觀察，測量其長、寬(表1)。其中早開堇菜、犁頭草種子較大，兩種種子顏色均為深褐色；另外三種植物種子相對較小，戟葉堇菜、長萼堇菜種子顏色均為深紅棕色，紫花堇菜種子顏色為深棕色。在電鏡掃描下，5種堇菜屬植物種子均為網狀紋飾，但網紋排列、規(guī)則度明顯不同，網眼大小各異(圖1)。以百粒法對5種野生堇菜屬植物千粒重進行測定，結果表明犁頭草種子千粒重>早開堇菜>紫花堇菜>戟葉堇菜>長萼堇菜，其中早開堇菜和犁頭草差異不顯著，與紫花堇菜、戟葉堇菜、長萼堇菜種子千粒重差異顯著(P<0.05)。

圖1 5種野生堇菜屬植物種子種皮微結構

2.1.2 種子吸水率

從吸水曲線看，5種野生堇菜屬植物種子的吸水率隨時間增加均表現為上升趨勢，2 h內為快速吸水期，2～12 h為緩慢吸水期，12 h基本達到飽和后吸水率趨于平穩(wěn)(圖2)。除紫花堇菜，三種處理均無顯著差異外，另外4種野生堇菜屬植物種子未處理及劃破種皮處理的吸水率無顯著差異(P<0.05)，吸水前2 h劃破種皮處理的種子表現為更高的吸水率，在吸水后期完整種子的吸水率略高于破皮種子，但去除種皮處理的吸水率低于前兩個處理。說明種皮對5種野生堇菜屬植物種子的吸水不起限制作用，相對種皮而言種子的胚乳組織更致密，沒有種皮的吸水以及持水特性。就吸水率而言，早開堇菜>犁頭草>戟葉堇菜=長萼堇菜>紫花堇菜，三種處理下紫花堇菜種子吸水率均表現為最低。

圖2 5種野生堇菜屬植物種子吸水曲線

2.1.3 種子生活力

5種野生堇菜屬植物種子屬于有胚乳種子，經染色，生活力最高的胚乳部分也被染成鮮紅色；次之，僅胚染為鮮紅；無生活力的種子胚沒有染色成功或染色面積少于1/2。根據5種野生堇菜屬植物種子生活力測定結果顯示，早開堇菜種子生活力最高，不僅胚染為鮮紅，而且多數胚乳也染為紅色；戟葉堇菜次之，少數胚乳染為紅色；其次為犁頭草、長萼堇菜，多為胚染色；紫花堇菜種子生活力最低，表現為染色面積小、顏色淺等現象。同種野生堇菜屬植物種子經過6個月儲藏后，生活力有所降低，除戟葉堇菜常溫儲存下生活力顯著降低外，其他堇菜屬植物種子在兩種儲存條件下種子生活力差異不顯著(P<0.05)；同種處理下，犁頭草、長萼堇菜種子生活力差異不顯著，其他幾種種子生活力差異顯著(圖3)。5種野生堇菜屬植物在染色6 h時被染種子數最多，6 h后出現褪色。

圖3 5種野生堇菜屬植物種子生活力

2.2 堇菜屬植物種子萌發(fā)特性

2.2.1 浸種對種子萌發(fā)的影響

結果表明，浸種處理的種子發(fā)芽率低于不做處理的種子，浸泡處理的種子發(fā)芽較早，但后期霉變嚴重，影響種子正常發(fā)芽。同種植物在不同處理下，早開堇菜、紫花堇菜差異不顯著，犁頭草、戟葉堇菜、長萼堇菜種子發(fā)芽率差異顯著(P<0.05)；同種處理下，5種野生堇菜屬植物種子發(fā)芽率差異顯著(P<0.05)，早開堇菜>戟葉堇菜>犁頭草>長萼堇菜>紫花堇菜(圖4)。

圖4 浸種處理對5種野生堇菜屬植物種子發(fā)芽率的影響

2.2.2 儲存條件對種子萌發(fā)的影響

除早開堇菜發(fā)芽率較高不受儲存條件影響外，另外4種植物表現為低溫儲存種子發(fā)芽率高于室溫儲存，不同處理下，早開堇菜、紫花堇菜發(fā)芽率差異不顯著，犁頭草、戟葉堇菜、長萼堇菜種子發(fā)芽率差異顯著(P<0.05)；室溫儲藏下長萼堇菜、紫花堇菜發(fā)芽率差異不顯著，其余三種種子發(fā)芽率差異顯著，低溫儲藏下，5種堇菜屬植物種子發(fā)芽率差異顯著(圖5)。與6月份發(fā)芽試驗相比，除早開堇菜外，種子發(fā)芽率隨儲存時間增加有所降低。

圖5 不同儲存條件對5種野生堇菜屬植物種子發(fā)芽率的影響

2.2.3 赤霉素處理對種子萌發(fā)的影響

結果表明：除紫花堇菜外，赤霉素處理可提高其他4種堇菜屬種子發(fā)芽率。

使用不同濃度GA3、不同時間浸泡處理的早開堇菜，與對照相比發(fā)芽率增加，差異顯著。相同浸泡時間下，750 mg/L GA3處理下早開堇菜發(fā)芽率最高，其次為500 mg/L GA3處理，差異不顯著，750 mg/L GA3處理8 h發(fā)芽率最高；經過赤霉素處理的早開堇菜6天內可完成發(fā)芽，發(fā)芽高峰期出現在第3天，且發(fā)芽率高達96%。

使用不同濃度GA3、不同時間浸泡處理的犁頭草，與對照相比發(fā)芽率增加，差異顯著。相同浸泡時間下，犁頭草在500 mg/L GA3處理時發(fā)芽率最高，其次為300 mg/L GA3處理，種子發(fā)芽率差異顯著，其中500 mg/L GA3浸泡8 h發(fā)芽率最高；經過300、500 mg/L GA3處理的犁頭草15 d內可完成發(fā)芽，發(fā)芽高峰期出現在第9 d，且發(fā)芽率高達44%。

戟葉堇菜在不同GA3濃度、不同時間浸泡處理下，與對照相比發(fā)芽率增加，差異顯著。相同浸泡時間下戟葉堇菜在500 mg/L GA3處理下發(fā)芽率較高，其次為750 mg/L，差異顯著，其中500 mg/L GA3處理8 h發(fā)芽率最高；經過300、500、750 mg/L GA3赤霉素處理的戟葉堇菜10 d內可完成發(fā)芽，發(fā)芽高峰期出現在第6天，且發(fā)芽率高達60%。

100 mg/L GA3浸泡處理長萼堇菜種子4 h、12 h、24 h與對照相比差異不顯著，其余處理與對照相比發(fā)芽率差異顯著。相同浸泡時間下500 mg/L GA3處理長萼堇菜發(fā)芽率較高，其次為300 mg/L，差異顯著，在500 mg/L GA3處理8 h下發(fā)芽率最高；經過300、500 mg/L GA3處理的長萼堇菜12 d內可完成發(fā)芽，發(fā)芽高峰期出現在第8 d，發(fā)芽率最高達36%(圖6)。紫花堇菜經過100～750 mg/L的赤霉素處理并不能發(fā)芽，有待進一步研究。

圖6 赤霉素處理對4種野生堇菜屬植物種子發(fā)芽率的影響

3 討論與結論

5種野生堇菜屬植物種子均為卵圓形，基部平鈍，頂端為萌發(fā)口尖突成喙狀。通過掃描電鏡對5種堇菜屬植物種子的表皮微結構進行觀察比較發(fā)現，5種植物種子均為網狀紋飾，早開堇菜、犁頭草、長萼堇菜紋飾排列較為整齊，網眼形狀各異；戟葉堇菜、紫花堇菜呈不規(guī)則的網狀紋飾，戟葉堇菜網脊突出，起伏較大，紫花堇菜網眼呈較規(guī)則的六邊形。李連方等[14]對華北地區(qū)22種堇菜屬植物種子進行掃描電鏡觀察，其中包括美麗堇菜亞屬(Subgen.Melanium)、二裂花柱亞屬(Subgen.Dischidium)及堇菜亞屬(Subgen.Viola)，堇菜亞屬種皮紋飾出現多元性分化，表現為更高的進化水平，研究結果與本文研究的5種野生堇菜亞屬植物種子電鏡掃描結果相同。不同種間堇菜屬植物種子表面微觀結構差異可作為不同種間堇菜屬植物種子差異鑒定的依據之一。在直觀的分類學上，種子表面微觀結構特征具有重要價值[15]。

充足的水分是堇菜屬植物種子萌發(fā)的必要條件之一。種子吸水使種皮軟化，增強其透氣性，種胚內酶活性隨之增強，其代謝活動更為活躍；反之，由于種子缺水，會導致種胚因缺乏營養(yǎng)物質致使發(fā)芽率降低[16]。常彥莉等[17]以貝母(FritillariaL.)種子為試驗材料，對其進行吸水試驗，結果將種子吸水過程分為急劇吸水階段、穩(wěn)定吸水階段和飽和吸水三個階段。潘春柳等[18]研究發(fā)現完整絞股藍種子和破皮絞股藍種子吸水率相差不大，說明種子休眠不是來源于種皮障礙，非物理休眠。本研究表明，5種野生堇菜屬植物種子前2 h為快速吸水期，與董慧等[19]研究結果一致；完整種子和破皮種子吸水率無顯著差異；去除種皮的堇菜屬植物種子因致密的胚乳以及沒有種皮吸水性和持水性而表現為較低的吸水率；紫花堇菜種子吸水率明顯低于其他4種植物種子，可能是由于致密的胚乳結構抑制其萌發(fā)[20]。

種子生活力測定結果表明，染色濃度為0.2%時，置于30℃培養(yǎng)箱中染色6 h效果最好，可以很好地檢測堇菜屬植物種子生活力水平，評估種子潛在發(fā)芽能力。低溫儲藏下不同種子生活力有不同程度的降低，除戟葉堇菜外，差異均不顯著，與張玲衛(wèi)等[21]研究結果一致。不同處理下，從種子生活力看，早開堇菜>戟葉堇菜>犁頭草=長萼堇菜>紫花堇菜。種子生活力測定方法受染色溫度、染色時間、染色濃度等多方面因素影響，對堇菜屬植物種子生活力最適測定方法還需進一步研究。

對5種野生堇菜屬植物種子萌發(fā)特性的研究結果表明，浸種處理的種子發(fā)芽較早，但浸種處理下種子萌發(fā)率較未處理種子低，原因可能是堇菜屬植物種子吸水性強，長時間浸泡使胚得不到有效呼吸，種子失活，后期霉變嚴重，影響種子正常發(fā)芽，因此播種時忌雨季及澆水過量；除早開堇菜外，低溫儲存的種子發(fā)芽率高于常溫儲存處理，與劉建成等[22]以川東獐牙菜種子為試驗材料，提出低溫下貯藏可延長種子壽命結果一致；經過6個月儲存，種子發(fā)芽率有所降低，該結果與盧軍[23]、趙陸滟[24]等的研究結果一致，但幾種堇菜屬植物種子生活力并沒有顯著下降，說明堇菜植物種子較耐儲存。幾種堇菜屬植物種子生活力均高于發(fā)芽率，其中，早開堇菜種子生活力平均值達96%，較發(fā)芽率平均值高出16%；犁頭草種子生活力平均值達42%，較發(fā)芽率平均值高出33%；戟葉堇菜種子生活力平均值達64%，較發(fā)芽率平均值高出36%；長萼堇菜種子生活力平均值達41%，較發(fā)芽率平均值高出46%；紫花堇菜種子生活力平均值達12%，較發(fā)芽率平均值高出83%，可能原因為種子在發(fā)育過程中形成胚，胚具活性卻未發(fā)育成熟而不具備發(fā)芽能力[25]。

GA3屬于促進植物生長的一種植物激素，是通過促進植物細胞的分裂來調控促進物與抑制物之間的平衡來提高種子發(fā)芽力。試驗結果表明，赤霉素濃度、處理時間均對堇菜屬植物種子發(fā)芽率有影響，早開堇菜種子發(fā)芽時間最早，戟葉堇菜次之，其次為長萼堇菜、犁頭草，紫花堇菜發(fā)芽最慢或不發(fā)芽；除紫花堇菜外，赤霉素處理可提高4種堇菜屬植物種子發(fā)芽率、縮短種子發(fā)芽時間，綜合經濟成本及發(fā)芽水平，其余4種野生堇菜屬植物種子在赤霉素濃度為500 mg/L下浸泡8 h效果最佳，該結果與盧精林等[26]的研究結果一致。野生紫花堇菜種子生活力低，6個月儲存后發(fā)芽率為0，有效種實少且不耐儲藏，推測由于紫花堇菜為5種野生堇菜屬植物中唯一具地上莖的植物，種實采集位置可能會影響種子發(fā)芽率[27]，因此對其種子萌發(fā)試驗有待進一步研究。