幾種抗高血壓藥物對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血單個核細胞IL-6、IL-17、IL-22 及IFN-γ 等細胞因子影響的研究

徐珂

（開封市人民醫(yī)院檢驗科，河南 開封475000）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）是一種慢性自身免疫性疾病，影響關(guān)節(jié)、結(jié)締組織、肌肉及纖維組織，還可引起骨和軟骨的變形[1]。 Th1/Th17 細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)是RA 的重要發(fā)病機制，細胞因子TNF、IL-6、IL-17 等是RA 發(fā)病的關(guān)鍵成分。 心血管疾病是RA 患者最常見的并發(fā)癥之一, 它使RA 的死亡率增加了兩倍[2]，RA 患者中系統(tǒng)性動脈高壓（SAH）的患病率高達53%~73%, 而一般人群中不超過23%[3]。 最近的研究突出了炎癥在高血壓發(fā)展中的作用，先天性免疫、效應(yīng)性和調(diào)節(jié)性T 細胞及共刺激分子與腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)相互作用，參與高血壓的發(fā)生[4]。

對RA 合并癥的治療，如SAH，優(yōu)選血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑和/或血管緊張素II 受體阻斷劑[5]。在對實驗性自身免疫性心肌炎大鼠的研究中,纈沙坦可抑制Th1 相關(guān)的細胞因子水平并顯著正向調(diào)節(jié)Th2 相關(guān)細胞因子, 證明纈沙坦可以作為Th細胞亞群平衡的調(diào)節(jié)劑[6]，另一方面，氯沙坦在心血管疾病患者中能夠降低IL-6 的水平和增加TGF-β 的產(chǎn)生[7]。 還有些研究發(fā)現(xiàn)，依那普利是一種弱免疫調(diào)節(jié)劑[8]。顯然這些藥物除了控制血壓外,還有不同程度的免疫調(diào)節(jié)作用，但它們對RA 患者外周血單個核細胞的作用尚不清楚。 本研究旨在探討氯沙坦、依那普利和纈沙坦對RA 患者外周血單個核細胞產(chǎn)生的細胞因子IL-2、IL-10、IL-6、IFN-γ、IL-17 和IL-22 的影響，并探討其與疾病活動性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 選取開封市人民醫(yī)院于2017 年1月至2018 年1 月收治的RA 患者20 例,均符合20 10 年美國風(fēng)濕病學(xué)會RA 的分類標(biāo)準(zhǔn)[9]，所有入選病例排除其他風(fēng)濕性疾病、心血管、內(nèi)分泌、甲狀腺、免疫調(diào)節(jié)性疾病和癌癥,收集患者的臨床資料，見表1。 根據(jù)患者疾病活動評分（DAS28）評價患者疾病的活動度。DAS28<3.2 為低度活動，3.2~5.1 為中度活動,>5.1 為高度活動。 研究對象知情同意并簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑 IL-2、IL-10、IL-6、IFN-γ、IL-17和IL-22 檢測ELISA 試劑盒購自默沙克生物科技有限公司。Ficoll-Hypaque 和抗CD3、抗CD28 單克隆抗體購自上海前塵生物科技有限公司。

1.3 檢測方法 無菌條件下抽取患者空腹靜脈血30ml，除了常規(guī)的血常規(guī)、類風(fēng)濕因子、血沉等檢測外，還做以下實驗。

將RA 患者的外周血在無菌條件下,用Ficoll-Hypaque 密度梯度離心分離,磷酸緩沖液洗滌2 次,計數(shù)后調(diào)整濃度為1×106/ml 接種于6 孔板， 每孔1ml。 設(shè)不加抗體的細胞為空白對照,用抗CD3 和抗CD28 單抗刺激細胞，刺激后不加藥物的為刺激組，刺激后加100μm 甲基強的松龍為陽性對照，實驗組分別加入100μm 氯沙坦、纈沙坦和依那普利,每組設(shè)3 個復(fù)孔。 各組細胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，收集上清液放于-80℃冰箱儲存。

酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）測定培養(yǎng)上清中的細胞因子,根據(jù)試劑盒說明書指示測定上清液中的細胞因子濃度。 IL-2、IL-10、IL-6、IFN-γ、IL-17和IL-22 的 最 低 檢 測 量 分 別 是4.0、4.69、4.69、9.38、18.75 和6.0 pg/ml。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0 軟件分析，計量資料以x±s 表示， 兩組間比較應(yīng)用t 檢驗，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RA 患者臨床和實驗室數(shù)據(jù) 20 例RA 患者均符合2010 年美國風(fēng)濕病學(xué)會RA 的分類標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)DAS28 對患者疾病活動進行定量, 收集臨床和實驗室數(shù)據(jù)，見表1。

表1 RA 患者臨床和實驗室數(shù)據(jù)

2.2 抗高血壓藥物對RA 患者PBMCs 的影響 與刺激組相比，氯沙坦顯著降低RA 患者外周血單個核細胞培養(yǎng)上清中的IFN-γ、IL-6、IL-17 和IL-22的濃度(P=0.005;0.000;0.000;0.000)，依那普利顯著降低IFN-γ、IL-22 的濃度(P=0.009;0.002)，纈沙坦沒有降低相關(guān)細胞因子的濃度。

2.3 抗高血壓藥物對RA 患者細胞因子及疾病活動度的影響 對于DAS28＜3.2 的RA 患者，氯沙坦能使IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-17 和IL-22 顯著下降(P=0.025; 0.005; 0.0046; 0.004; 0.035)， 而 對 于DAS28＞3.2 的RA 患者，氯沙坦能使IL-22 顯著下降（P＝0.002），差異有統(tǒng)計學(xué)意義，依那普利和纈沙坦治療后細胞因子的變化和DAS28 無相關(guān)性。

3 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展與免疫細胞功能的失衡有關(guān)，包括B 淋巴細胞、CD4+T 細胞及其亞群，在RA 發(fā)病機制中最主要的細胞因子包括Th1和Th17 細胞產(chǎn)生的炎性細胞因子。 RA 患者普遍患有心血管疾病, 超過70%的RA 合并CVC 的患者高表達炎性免疫學(xué)標(biāo)志物, 包括C 反應(yīng)蛋白等[10]。體內(nèi)和體外實驗已經(jīng)有力證明某些抗高血壓藥物具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)功能,然而這些藥物在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病中的潛力尚未證實,我們根據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)，探討抗高血壓藥物對RA 患者外周血單個核細胞與疾病活性相應(yīng)的變化中的作用。

圖1 ELISA 檢測幾種降壓藥對RA 患者外周血單個核細胞分泌IL-2、IL-6、IL-17、IL-22 及IFN-γ 的影響

圖2 100μm 依那普利、氯沙坦和纈沙坦對不同DAS28 評分患者外周血單個核細胞分泌細胞因子IFN-γ、IL-2、IL-6、IL-10、IL-17、IL-22 的影響

RA 中的系統(tǒng)性高血壓患者，治療時優(yōu)選血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑和/或血管緊張素II 受體阻斷劑，這些藥物用于治療心血管疾病效果良好[11]。 心血管危險因素和全身炎癥與RA 患者頸動脈內(nèi)膜-中膜厚度的快速進展有關(guān),因此有必要檢測抗高血壓藥物是否參與免疫調(diào)節(jié)作用，這有利于為RA 患者選取更合適的治療方案。本結(jié)果表明，在CD3 和CD28 抗體刺激RA 患者外周血單個核細胞（PBMC）時,氯沙坦能夠顯著降低PBMC 分泌的IF N-γ、IL-6、IL-17 和IL-22 的濃度, 依那普利和對PBMC 中促炎因子的產(chǎn)生幾乎沒有調(diào)節(jié)作用。

促炎性細胞因子參與RA 的發(fā)病，IL-17 是其中之一，它存在于滑膜中，能夠加重RA 患者的病情，而且人們發(fā)現(xiàn)，IL-17 在動脈高壓的發(fā)病中，對誘導(dǎo)血管生成因子的產(chǎn)生和促進內(nèi)皮細胞的遷移起著關(guān)鍵的作用[12,13],IL-17 還激活血清和糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)激酶Ⅰ依賴途徑, 引起水和鈉的代謝不平衡，從而升高血壓[14]。 因此，降低循環(huán)水平的IL-17不僅可以改善RA 的癥狀,也有利于高血壓患者血壓的控制。 氯沙坦在100μm 濃度下能夠降低IL-17 的水平, 此外通過DAS28 對RA 患者病情進行評估, 氯沙坦能夠降低輕中度患者細胞因子的水平,但是對重度評分的患者無影響,而依那普利和纈沙坦對細胞表達因子的沒有影響。

IFN-γ 和IL-6 是兩種具有多種功能的炎性細胞因子，如促進免疫細胞的增殖和參與免疫調(diào)節(jié)，IFN 家族與RA 的發(fā)病有關(guān)，IL-6 也是RA 治療的靶點之一。

IL-6 與C-反應(yīng)蛋白水平、關(guān)節(jié)腫脹程度、DAS 28、類風(fēng)濕因子及抗瓜氨酸抗體相關(guān)。 IL-22 是一種多效細胞因子, 通過MAPK/NF-κB 和JAK-2/ST AT-3 信號通路的激活介導(dǎo)破骨細胞激活，破環(huán)關(guān)節(jié)軟骨，IL-22 也可能會成為RA 治療的靶點[15,16]。本實驗發(fā)現(xiàn)氯沙坦顯著降低RA 患者外周血單個核細胞中的IFN-γ、IL-6、IL-17 和IL-22 的濃度，依那普利顯著降低IFN-γ、IL-22 的濃度， 纈沙坦沒有降低相關(guān)細胞因子的濃度。 對DAS28＜3.2 的病人,氯沙坦能使IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-17 和IL-22 顯著下降， 而對于DAS28＞3.2 的病人,氯沙坦能使IL-22 顯著下降。

對于評估的所有細胞因子,我們觀察到疾病活動嚴(yán)重的患者（DAS28>3.2）氯沙坦僅能降低IL22的濃度,目前認(rèn)為IL-22 是RA 發(fā)病過程中關(guān)鍵的細胞因子之一,IL22 的反應(yīng)性和ESR、CRP、DAS28及骨損傷程度相關(guān)[17]，所以對于嚴(yán)重的RA 患者，氯沙坦也有一定的調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的作用。 病情嚴(yán)重的患者可能因使用潑尼松等激素抗炎治療而使免疫細胞對藥物反應(yīng)變得不敏感，但RA 是一種慢性和退行性疾病,很難在不進行抗炎的情況下招募患者，這使體外研究更加的困難。 本實驗準(zhǔn)備進一步選擇RA 合并高血壓，但未用抗高血壓藥物治療的患者，觀察這些患者在加服氯沙坦后，血清IL22等細胞因子濃度的變化及外周血單個核細胞內(nèi)通路的改變來明確氯沙坦的作用機制。

綜上所述，在依那普利、氯沙坦和纈沙坦這三種抗高血壓藥物中,氯沙坦對RA 患者的PBM C 有免疫調(diào)節(jié)作用，可以作為RA 合并高血壓的選擇藥物。