藍(lán)莓花青素微膠囊的制備工藝優(yōu)化

吳曉齡，王建飛，潘利華，成玉娟

（合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，安徽 合肥 230009）

藍(lán)莓是一種味甜多汁的深藍(lán)色漿果，具有抗癌、緩解視疲勞、延緩衰老和護(hù)膚等功效[1]。藍(lán)莓富含酚酸、木質(zhì)素、單寧等酚類(lèi)化合物和花青素、黃烷醇等黃酮類(lèi)化合物，其中藍(lán)莓中的花青素是所有水果蔬菜里含量最多的[2]?；ㄇ嗨匾蚱淇寡趸⒖拱?、保護(hù)視網(wǎng)膜、降低血脂、抗衰老和改善腸道健康等益處而深受人們的關(guān)注[3]。然而花青素是水溶性的，極不穩(wěn)定，它們很容易被各種因素降解，如pH 值、氧氣、酶、抗壞血酸、二氧化硫或亞硫酸鹽、金屬離子等。因此，如何提高花青素穩(wěn)定性的研究一直沒(méi)有停止[4-5]。

微膠囊化是提高對(duì)溫度、光和氧氣等環(huán)境敏感的生物活性化合物穩(wěn)定的有效方法，采用噴霧干燥法制備微膠囊，可以提高它們的穩(wěn)定性[6-7]。通過(guò)微膠囊化法，在干燥過(guò)程中用蛋白質(zhì)、多聚糖等多種高分子化合物包裹花青素，將花青素包埋在聚合物基質(zhì)中，減少氧氣的接觸量，提高穩(wěn)定性。Cai X 等人[8]以羥甲基淀粉復(fù)合黃原膠為壁材包埋花青素，發(fā)現(xiàn)可以提高藍(lán)莓花青素的穩(wěn)定性。Da Rosa J R 等人[9]以麥芽糖糊精和玉蜀黍?yàn)楸诓?，采用噴霧干燥法制備藍(lán)莓花青素微膠囊，有助于提高花青素的穩(wěn)定性。以藍(lán)莓花青素的包埋率在模擬胃液及腸液中釋放率為指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)方法，比較分析了大豆分離蛋白、乳清蛋白、果膠、殼聚糖為單一壁材，以及不同濃度的單一壁材進(jìn)行復(fù)合后的復(fù)合壁材對(duì)藍(lán)莓花青素包埋效果的影響，篩選出了最適的復(fù)合壁材及藍(lán)莓花青素膠囊的制備工藝，為生產(chǎn)藍(lán)莓花青素微膠囊提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)莓鮮果，安徽徽王食品有限公司提供；殼聚糖，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；果糖，合肥精料化學(xué)試劑有限公司提供；大豆分離蛋白，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供；乳清分離蛋白，河南眾信化工產(chǎn)品有限公司提供；矢車(chē)菊素- 3- O-葡萄糖苷，上海撫生實(shí)業(yè)有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

BUCHI B-290 型噴霧干燥機(jī)，日本日立公司產(chǎn)品；RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠(chǎng)產(chǎn)品；ZQ-4000/2695 型液質(zhì)聯(lián)用色譜儀，Agilengt 公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 藍(lán)莓花青素的提取

稱(chēng)取一定質(zhì)量的冷凍藍(lán)莓，室溫解凍后使用組織搗碎機(jī)破碎，75%的酸性乙醇為提取劑，料液比1∶8，在提取溫度60 ℃，提取時(shí)間150 min，pH 值3.0 的條件下進(jìn)行提取、抽濾，然后在溫度50 ℃的條件下進(jìn)行減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到藍(lán)莓提取液。接著以AB-8 型大孔吸附樹(shù)脂為吸附劑，溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%的乙醇為洗脫劑，在溫度50 ℃的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到藍(lán)莓花青素溶液[10]。

1.3.2 藍(lán)莓花青素的成分分析

提取液中藍(lán)莓花青素的成分分析采用HPLC 法。①色譜條件：色譜柱為Waters Xbridge C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。流動(dòng)相的A 相為5%甲酸水溶液，B 相為乙腈。進(jìn)樣量20 μL，流速0.8 mL/min，柱溫25 ℃。線(xiàn)性洗脫梯度：0～15 min，5%～10% B；15～30 min，10%～13% B；30～34 min，13%～20% B；34～40 min，20%～25% B；40～43 min，25%～100%B；DAD 檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為530 nm。色譜柱分離后樣品經(jīng)三通閥分流進(jìn)入質(zhì)譜分析。②質(zhì)譜條件：電噴霧離子源；數(shù)據(jù)采集使用軟件Agilent Chemstation Rev.A.09.01 software（Agilent，Palo Alto，CA）；正 離 子掃描模式，掃描范圍m/z 100～1 500，干燥氣溫度350 ℃，氮?dú)饬魉?2 L/min，毛細(xì)管電流34 nA，霧化器壓力0.31 MPa[11]。

1.3.3 藍(lán)莓花青素微膠囊的制備

分別配制4 種不同的復(fù)合壁材溶液，以及藍(lán)莓花青素芯材溶液。然后將芯材溶液分別加入到壁材溶液中，均質(zhì)并調(diào)節(jié)pH 值，得到芯壁混合液。最后將芯壁混合液在噴霧干燥機(jī)中噴霧干燥，得到粉末狀的花青素微膠囊。

1.3.4 藍(lán)莓花青素微膠囊的制備工藝優(yōu)化

（1） 單因素試驗(yàn)。在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以花青素微膠囊的包埋率、胃釋放率和腸釋放率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇乳清分離蛋白（WPI）、大豆分分離蛋白（SPI）、殼聚糖（CS）、果膠（PC） 為4 種原料，制備WPI+CS，WPI+PC，SPI+CS，SPI+PC 4 種復(fù)合壁材溶液，設(shè)定芯、壁材體積比1∶4，芯壁混合液pH 值2.0，進(jìn)風(fēng)溫度165 ℃，出風(fēng)溫度70 ℃為基礎(chǔ)制備工藝參數(shù)，固定其中3 項(xiàng)參數(shù)，改變另一參數(shù)，分析芯、壁材體積比（1∶1.5，1∶2.0，1∶3.0，1∶4.0，1∶5.0，1∶6.0，1∶7.0），芯壁混合液pH 值（1.0，1.5，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0），進(jìn)風(fēng)溫度（155，160，165，170，180，190 ℃），出風(fēng)溫度（60，70，80，90，100，110 ℃） 對(duì)花青素微膠囊的包埋率、胃釋放率和腸釋放率的影響。

（2） 正交試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇芯、壁材體積比、芯壁混合液pH 值、進(jìn)風(fēng)溫度、出風(fēng)溫度4 個(gè)因素，采用四因素三水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，以微膠囊的包埋率、停留2 h 后的胃釋放率和腸釋放率為指標(biāo)，確定最適的工藝。

1.3.5 花青素微膠囊包埋率的測(cè)定[12]

表面花青素含量：取0.1 g 微膠囊成品溶于無(wú)水乙醇后離心取上清液，測(cè)定吸光度，得表面花青素的含量。

總花青素的含量：取0.1 g 微膠囊成品溶于20%的乙醇水溶液，測(cè)定吸光度，得總花青素的含量。

1.3.6 花青素微膠囊釋放率的測(cè)定[13]

取100 mg 的微膠囊成品用乙醇溶液沖洗去除表面花青素，離心后取沉淀物和15 mL 模擬胃液置于錐形瓶中，放置水浴搖床上振蕩2.0 h，測(cè)定吸光度，得花青素微膠囊在模擬胃液中的釋放率。

取100 mg 的微膠囊成品用乙醇溶液沖洗去除表面花青素，離心后取沉淀物和15 mL 模擬腸液置于錐形瓶中，放置水浴搖床上振蕩2.0 h，測(cè)定吸光度，得花青素微膠囊在模擬腸液中的釋放率。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓花青素的成分分析

藍(lán)莓花青素各組分的質(zhì)譜信息及其結(jié)構(gòu)推測(cè)見(jiàn)表1。

由表1 可以看出，藍(lán)莓花青素成分主要由飛燕草- 3 - 半乳糖苷、飛燕草- 3 - 葡萄糖苷、矢車(chē)菊-3 - 半乳糖苷、矢車(chē)菊- 3 - 葡萄糖苷、牽?；? 3 -半乳糖苷、矢車(chē)菊- 3 - 阿拉伯糖苷、牽?；? 3 -葡萄糖苷、芍藥素- 3 - 葡萄糖苷、錦葵素- 3 - 半乳糖苷、錦葵素- 3 - 葡萄糖苷和錦葵素- 3 - 阿拉伯糖苷組成。其中，錦葵素- 3 - 半乳糖苷含量最多占21.44%，飛燕草- 3- 葡萄糖苷含量最少占2.56%。Cesa S等人[14]對(duì)經(jīng)過(guò)不同均質(zhì)化和熱處理后的藍(lán)莓樣品進(jìn)行HPLC-DAD 分析，發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓花青素成分主要有飛燕草半乳糖衍生物、飛燕草阿拉伯糖衍生物、錦葵素半乳糖衍生物和錦葵素阿拉伯糖苷衍生物組成。

表1 藍(lán)莓花青素各組分的質(zhì)譜信息及其結(jié)構(gòu)推測(cè)

2.2 藍(lán)莓花青素微膠囊化的復(fù)合壁材的篩選

復(fù)合壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)花青素微膠囊包埋率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 復(fù)合壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)花青素微膠囊包埋率的影響

從圖1 可知，WPI，SPI，CS，PC 質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)藍(lán)莓花青素的包埋率都有影響，當(dāng)果膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)或殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)相同時(shí)，高質(zhì)量分?jǐn)?shù)和中質(zhì)量分?jǐn)?shù)的WPI，SPI 樣品的包埋率明顯高于低濃度相應(yīng)樣品的包埋率（p<0.05），但高質(zhì)量分?jǐn)?shù)與中質(zhì)量分?jǐn)?shù)的WPI 樣品及高質(zhì)量分?jǐn)?shù)與中質(zhì)量分?jǐn)?shù)的SPI 樣品的包埋率沒(méi)有顯著差異（p>0.05）。當(dāng)WPI 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%和15%，SPI 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%和6%時(shí)，樣品的包埋率隨著CS 質(zhì)量分?jǐn)?shù)或PC 質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而提高。這可能是由于WPI 溶液和SPI 中的疏水區(qū)域增加了非極性相互作用，從而提高了花青素微膠囊的包埋率[15]；也可能由于噴霧干燥過(guò)程中有少量蛋白質(zhì)共價(jià)連接至果膠中，能更好地包埋花青素分子，保護(hù)花青素中的離子不易受到水分子的親核攻擊，從而增加了花青素的穩(wěn)定性[16]。圖1 結(jié)果還表明，以4%SPI+2% PC 為復(fù)合壁材時(shí)，藍(lán)莓花青素微膠囊的包埋率最高，為91.49%。

2.3 藍(lán)莓花青素微膠囊制備的單因素影響

2.3.1 芯、壁材體積比的影響

不同芯壁材體積比對(duì)藍(lán)莓花青素微膠囊化的影響見(jiàn)圖2。

圖2 不同芯壁材體積比對(duì)藍(lán)莓花青素微膠囊化的影響

從圖2 可知，藍(lán)莓花青素的包埋率隨著芯壁材體積比的變大先升高后趨于平緩，芯、壁材體積比1∶4時(shí)包埋率最大，為91.17%。這可能由于隨著芯壁比的增加，包裹的花青素含量逐漸增大[17]。花青素微膠囊的胃釋放率隨著芯壁材體積比的變小而逐漸降低。在芯壁材體積比大于1∶3 時(shí)，下降趨勢(shì)明顯且均低于80%?；ㄇ嗨氐哪c釋放率和胃釋放率的趨勢(shì)一致。這可能由于芯壁體積比的增加，體系的濃度變大，液滴發(fā)生聚集[18]，影響了花青素微膠囊中內(nèi)容物的釋放。

2.3.2 芯壁混合液pH 值的影響

pH 值對(duì)藍(lán)莓花青素微膠囊化的影響見(jiàn)圖3。

圖3 pH 值對(duì)藍(lán)莓花青素微膠囊化的影響

從圖3 可知，藍(lán)莓花青素微膠囊的包埋率隨著芯壁混合液pH 值的增大先保持平緩趨勢(shì)后下降，芯壁混合液pH 值為2 時(shí)包埋率最大，為89.55%。這可能由于在pH 值< 2 時(shí)，SPI 與PC 發(fā)生聚合能夠較好地包裹花青素；當(dāng)pH 值> 2 時(shí)，由于壁材的成膜率下降，導(dǎo)致了花青素微膠囊包埋率的降低[19]?；ㄇ嗨匚⒛z囊的胃釋放率隨著芯壁混合液pH 值的增大基本無(wú)顯著性的變化，表明芯壁混合液pH 值對(duì)花青素微膠囊的包埋率幾乎沒(méi)有影響。花青素的腸釋放率隨著芯壁混合液pH 值的增大而降低。這可能由于在腸道消化環(huán)境中，較高的pH 值（中性或堿性） 對(duì)花青素的穩(wěn)定性有不利的影響[20]。

2.3.3 進(jìn)風(fēng)溫度的影響

進(jìn)風(fēng)溫度對(duì)藍(lán)莓花青素微膠囊化的影響見(jiàn)圖4。

圖4 進(jìn)風(fēng)溫度對(duì)藍(lán)莓花青素微膠囊化的影響

從圖4 可知，藍(lán)莓花青素微膠囊的包埋率隨著進(jìn)風(fēng)溫度的升高先升高后趨于平緩。這可能由于較高的溫度增加了液滴的干燥速度，加快了硬殼的快速形成[21]， 因此可以更好地包裹花青素。此外，還可能由于高溫增加分子的熱運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)花青素和壁材之間的相互作用，因此提高了花青素微膠囊的包埋率[22]?；ㄇ嗨匚⒛z囊的胃釋放率隨著進(jìn)風(fēng)溫度的增加先升高后降低，當(dāng)進(jìn)風(fēng)溫度160 ℃時(shí)胃釋放率最高，為75.05%。花青素微膠囊的腸釋放率和胃釋放率的趨勢(shì)一致。當(dāng)進(jìn)風(fēng)溫度165 ℃時(shí)腸釋放率最高，為92.12%。

2.3.4 出風(fēng)溫度的影響

出風(fēng)溫度對(duì)藍(lán)莓花青素微膠囊化的影響見(jiàn)圖5。

圖5 出風(fēng)溫度對(duì)藍(lán)莓花青素微膠囊化的影響

從圖5 可知，藍(lán)莓花青素微膠囊的包埋率隨著出風(fēng)溫度的增加先升高后降低，在出風(fēng)溫度70℃時(shí)包埋率最高，為90.76%。這可能由于出風(fēng)溫度高導(dǎo)致微膠囊產(chǎn)生裂縫，分裂并釋放花青素。還可能由于出風(fēng)溫度過(guò)高會(huì)影響水蒸發(fā)與成膜率速率之間的平衡[23]，破壞壁材基質(zhì)，從而降低花青素微膠囊的包埋率?；ㄇ嗨匚⒛z囊的胃釋放率隨著出風(fēng)溫度的升高基本沒(méi)有變化，胃釋放率值均在75%以下，表明出風(fēng)溫度對(duì)花青素微膠囊的胃釋放率基本沒(méi)有影響?；ㄇ嗨匚⒛z囊的腸釋放率隨著進(jìn)風(fēng)溫度的升高先升高后降低。當(dāng)出風(fēng)溫度為70～100 ℃時(shí)，花青素微膠囊的腸釋放率降低不顯著，表明此溫度范圍內(nèi)對(duì)花青素微膠囊的腸釋放率沒(méi)有影響。

2.4 藍(lán)莓花青素微膠囊制備的正交試驗(yàn)優(yōu)化

花青素微膠囊化正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析見(jiàn)表3。

表2 花青素微膠囊化正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析

由正交試驗(yàn)結(jié)果表明，影響藍(lán)莓花青素微膠囊包埋率的先后因素為A>C>D>B，即芯壁材比>進(jìn)風(fēng)溫度>出風(fēng)溫度> pH 值。影響藍(lán)莓花青素微膠囊的腸釋放率的主次因素為A>B>C>D，既芯壁材比>pH 值>進(jìn)風(fēng)溫度>出風(fēng)溫度。根據(jù)正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果，可以得到制備藍(lán)莓花青素微膠囊的最佳工藝A2B2C2D1，方差分析結(jié)果表明芯壁材比、pH 值、進(jìn)風(fēng)溫度和出風(fēng)溫度對(duì)包埋率影響不顯著，芯壁材比對(duì)藍(lán)莓花青素微膠囊的腸釋放率具有顯著性影響，其他因素對(duì)其影響均不顯著。藍(lán)莓花青素微膠囊的制備最佳工藝為芯壁材比1∶4，pH 值2.0，進(jìn)風(fēng)溫度165 ℃，出風(fēng)溫度70 ℃。在最佳工藝條件下進(jìn)行3 次重復(fù)試驗(yàn)，所得藍(lán)莓花青素微膠囊的包埋率為93.52%±0.88%，在腸液中的釋放率為92.65%±0.63%。

3 結(jié)論

酸提法從藍(lán)莓漿果中提取的花青素主要有飛燕草糖苷、矢車(chē)菊糖苷、牽?；ㄌ擒?、芍藥素糖苷、錦葵素糖苷等11 種糖苷組成。其中，錦葵素- 3 -半乳糖苷含量最高，為21.44%；飛燕草- 3 - 葡萄糖苷含量最少，為2.56%。噴霧干燥法制備藍(lán)莓花青素膠囊的最適工藝為4%藍(lán)莓花青素溶液為芯材，4% SPI+2% PC 混合物為壁材溶液，芯、壁體積比1∶4，芯壁混合液pH 值2.0，進(jìn)風(fēng)溫度165 ℃，出口溫度70 ℃，在此條件下制備的藍(lán)莓花青素微膠囊的包埋率為93.52%，腸釋放率為92.65%。