2016—2019年廣西玉林市送檢病死鴨的鴨圓環(huán)病毒檢測

（玉林市動物疫病預防控制中心，廣西玉林 537000）

鴨圓環(huán)病毒（duck circovirus，DuCV）屬于圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬，病毒粒子無囊膜，呈二十面體對稱，直徑約15 nm，核酸為單股環(huán)型DNA，是目前已知最小的鴨病毒。Hattermann 等[1]研究發(fā)現，DuCV 感染造成的淋巴組織損傷導致了機體體液免疫和細胞免疫功能的下降，這種免疫抑制反應增強了其他共感染因素的致病性。施少華等[2]研究發(fā)現，大部分品種及不同日齡的鴨對DuCV 均易感。2014年粟艷瓊[3]等發(fā)現，廣西家禽市場健康鴨群的DuCV 平均檢出率為8.01%，其中玉林市為1.36%。2016年楊晶[4]等對我國部分地區(qū)采集的302 份鴨組織樣品，進行了7 種常見鴨病毒性疫病檢測，結果發(fā)現DuCV 檢出率高達20.2%，說明DuCV 已成為我國鴨群中的主要流行病原之一。

玉林市養(yǎng)殖信息報送系統(tǒng)提供的統(tǒng)計數據顯示，玉林市2016—2019年鴨平均存欄量為1 170.73 萬只，且鴨養(yǎng)殖規(guī)模逐年增長，已成為廣西重要的鴨養(yǎng)殖基地。DuCV 常呈隱性和混合感染，感染后的臨床癥狀不典型，需要輔助以分子生物學方法進行確診[5]。為初步了解玉林市DuCV 感染情況，對2016—2019年部分養(yǎng)鴨場送檢的病死鴨組織樣品，通過PCR 方法進行病原檢測，以期為玉林市DuCV 感染防控提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 病料樣品

2016—2019年廣西玉林市629 個養(yǎng)鴨場送檢的病死麻鴨、櫻桃鴨、白鴨、鬼頭鴨的肺臟、胰腺、脾臟、肝臟、腦組織樣品共856 份。其中，2016年137 個養(yǎng)鴨場送檢168 份，2017年127 個養(yǎng)鴨場送檢189 份，2018年146 個養(yǎng)鴨場送檢196 份，2019年219 個養(yǎng)鴨場送檢303 份（表1）。

1.2 試劑與儀器

核酸自動抽提試劑盒：購于天根公司；PCR 擴增試劑盒：購自TaKaRa 公司；瓊脂糖：BIOWEST 公司產品；DL 2 000 DNA Marker：購自TaKaRa 公司。核酸凝膠成像儀：型號BioDocit 220，UVP 公司產品。高速冷凍離心機：型號CT15RT，上海天美科學儀器有限公司產品。

表1 2016—2019年廣西玉林市養(yǎng)鴨場送檢情況

1.3 引物設計與合成

根據參考文獻[6]設計1 對DuCV 引物：上游引物5'-GTCGCTGGGAGGAAGAGC-3'；下游引物5'-GTAATACTTGTTTTCGGCGGG-3'。擴增片段大小為351 bp。引物均由InvitrogenTM公司合成。

1.4 PCR 擴增

PCR 反應體系（25 μL）：模板產物3 μL，上下游引物（20 mmol/L）各0.25 μL，2×PCR Master MiX 12.5 μL，ddH2O 9 μL。擴增程序[6]：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共進行35 個循環(huán)；最后再經72 ℃延伸10 min 后，于4 ℃結束反應。取5 μL PCR 產物在1.0%瓊脂凝膠上進行核酸電泳，在陰、陽性對照均成立的情況下，于核酸凝膠成像儀中觀察檢測結果。

1.5 其他細菌及病毒檢測

無菌采集病死鴨肝臟、肺臟、脾臟、胰腺組織分裝，以無菌PBS 緩沖液，按質量比1:5 稀釋后研磨，用高速冷凍離心機12 000 r/min離心5 min后，提取200 μL 上清液，使用核酸自動抽提試劑盒，按步驟抽提核酸。根據參考文獻[8-13]中的PCR/RT-PCR 檢測方法，分別進行副黏病毒、禽多殺性巴氏桿菌、鴨疫里默氏桿菌、鴨黃病毒、大腸桿菌、鴨細小病毒等6 種病原的核酸檢測。

2 結果

2.1 總體情況

2016—2018年，856 份病死鴨樣品中，共檢出DuCV 陽性91 份，平均檢出率為10.63%。2016年檢出率為2.38%，2018年上升至16.33%，2019年又下降至14.52%（表2）。玉林市所有7 個管轄縣（市、區(qū)）、所有品種鴨均有陽性樣品被檢出，其中不同縣（市、區(qū)）的陽性檢出率介于9.89%～20.88%，不同品種鴨的檢出率介于8.79%～28.57%。

表2 2016—2019年廣西玉林市病死鴨DuCV 檢出情況

2.2 不同日齡

不同日齡的統(tǒng)計結果（表3）顯示：1～20日齡的DuCV 檢出率最低，為8.67%；21～65日齡檢出率最高，為15.11%。

表3 各日齡段病死鴨DuCV 檢出情況統(tǒng)計

2.3 不同月份

不同月份的統(tǒng)計結果（表4）顯示：上年12月—2月、3—5月的DuCV 檢出率較高，分別為11.88%、13.15%；而6—8月、9—11月較低，分別為4.35%、8.56%。

2.4 混合感染

對91 份DuCV 陽性樣品進行細菌及其他病毒的核酸檢測，發(fā)現有87 份存在混合感染，占比為95.60%（87/91）。混合感染均是DuCV 分別與禽多殺性巴氏桿菌、副黏病毒、鴨疫里默氏桿菌的雙重感染，檢出率分別為47.13%（41/87）、28.74%（25/87）、24.14%（21/87）。

表4 不同月份病死鴨DuCV 檢出情況統(tǒng)計

3 分析與討論

3.1 流行形勢

檢測發(fā)現，廣西玉林市鴨場送檢的病死鴨樣品DuCV 檢出率為10.63%，說明該地存在一定水平的DuCV 流行，這與施少華[2]等檢測的我國部分地區(qū)病死鴨15.28%的DuCV 個體陽性率基本相符。不同地區(qū)、不同品種鴨均有陽性樣品被檢出，說明玉林市的DuCV 流行范圍較廣，對鴨養(yǎng)殖業(yè)影響較嚴重。因為本次檢測的是病死鴨，所以相比粟艷瓊[3]等對當地健康鴨DuCV 的個體陽性檢出率1.36%有所偏高。從不同年份的統(tǒng)計結果來看，玉林市DuCV 感染率整體呈上升趨勢，2017年DuCV 檢出率較2016年上升了3.44%，2018年較2017年上升10.51%。雖然2019年較2018年下降了1.81%，但由于病死鴨檢測數量有限，且未對健康鴨帶毒情況進行研究，暫不能說明DuCV 感染得到了控制，仍需加強防控。

3.2 感染日齡及易發(fā)季節(jié)

從不同日齡的陽性檢出率可以發(fā)現，雖然各年齡段的鴨中都有DuCV 檢出，但21日齡以上病死鴨的檢出率（14.25%）高于20日齡以內（7.76%），這可能與該病毒能夠被鴨隱性攜帶有關。本次檢測結果與施少華等[2]的病死鴨DuCV 檢測結果基本相符。不同月份統(tǒng)計結果統(tǒng)計發(fā)現，上年12月—2月和3—5月的DuCV 陽性檢出率較高，說明玉林市DuCV流行有一定的季節(jié)性特征，春冬季節(jié)高發(fā)，這可能與當地春季的“回南天”氣候和冬季溫度驟降過快有關。這與楊晶等[4]在我國部分地區(qū)鴨病毒性疫病流行病學調查中發(fā)現的DuCV 季節(jié)性特征相似。

3.3 混合感染

本研究發(fā)現，DuCV 與禽多殺性巴氏桿菌、鴨疫里默氏桿菌、副黏病毒的混合感染比例較高（95.60%），與施少華[2]和黃瑜[7]對DuCV 與鴨疫里默氏桿菌混合感染研究數據相似，驗證了Hattermann 等[1]的研究結論——DuCV 能夠破壞鴨的免疫器官，易繼發(fā)細菌和其他病毒的感染。

4 結論

廣西玉林地區(qū)養(yǎng)鴨場中廣泛存在DuCV流行，各日齡段的鴨均有感染；本病具有一定的季節(jié)性特征，以春、冬兩季檢出率較高；DuCV 易與其他病毒和細菌發(fā)生混合感染。因此，需要在春冬高發(fā)季節(jié)，采取綜合防控措施，加強DuCV 感染以及與其他病原混合感染的控制。