遼寧省錦州市動物園一起孔雀H7N9 流感疫情的緊急流行病學調查

蘭德松，張冬野，劉 華，顧貴波，于本良

（1.遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務中心，遼寧省動物醫(yī)學研究院，遼寧沈陽 110164；2.錦州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村綜合服務中心，遼寧錦州 121004；3.安徽省動物疫病預防控制中心，獸醫(yī)病理生物學與疫病防控安徽省重點實驗室，安徽合肥 230091）

2013年3月，我國首次在上海市和安徽省發(fā)現(xiàn)3 例人H7N9 流感病例[1]。研究[2-3]表明，人H7N9 流感病例是由新的重組型禽源H7N9 流感病毒感染所致。截至目前，我國已經(jīng)發(fā)生了5 波人H7N9 流感疫情，其中浙江、江蘇和廣東等沿海省份感染病例居多[4]。研究[5-6]表明：起初H7N9 流感病毒對家禽表現(xiàn)為低致病力或無致病性，但在2016年底至2017年第5 波人H7N9 流感疫情流行期間，從人和禽體內(nèi)均分離到高致病力的變異型H7N9 流感病毒；經(jīng)病毒裂解位點分析和動物試驗，發(fā)現(xiàn)分離毒株對雞等家禽具有高致病力，且具備了比低致病性H7N9 毒株更強的哺乳動物體內(nèi)適應能力。自2017年9月以來，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部實施了家禽 H7N9 流感強制免疫與撲殺相結合的綜合防治策略，取得良好的防治效果，人間感染病例明顯減少。但由于部分省份活禽交易普遍以及候鳥遷徙等因素的存在，禽間的H7N9 流感疫情時有發(fā)生。近年來，國內(nèi)外還發(fā)生了多起野生鳥類及家禽的高致病性H7N9 流感疫情。

2019年3月18日，遼寧省錦州市農(nóng)業(yè)農(nóng)村綜合服務中心（以下簡稱“錦州市疫控中心”）獸醫(yī)實驗室接到錦州市動物園觀賞孔雀連續(xù)兩天出現(xiàn)異常死亡的報告。錦州市疫控中心立即組織專家組進行了現(xiàn)場剖檢診斷，并采集死亡孔雀臟器和雙拭子樣品進行了實驗室檢測，發(fā)現(xiàn)為H7N9 流感病毒核酸陽性；遂即將情況上報遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳，并采集相關樣品送遼寧省動物疫病預防控制中心（以下簡稱“遼寧省疫控中心”）檢測。3月19日，經(jīng)省級復檢，確定為H7N9 流感疑似疫情；3月20日，經(jīng)哈爾濱獸醫(yī)研究所國家禽流感參考實驗室進行病毒分離鑒定并測序分析，確診為高致病性H7N9 流感疫情。3月25日，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公布了該起孔雀高致病性H7N9 流感疫情。遼寧省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳在接到錦州市疫情報告后，立即組織省級疫情處置專家組赴現(xiàn)場開展了緊急流行病學調查，對疫情進行了追蹤溯源，評估了傳播風險，同時指導疫情處置工作。

1 病例定義

1.1 臨床懷疑病例

自2019年2月25日以來，在錦州市動物園飼養(yǎng)的孔雀等觀賞禽類，以及周邊家禽養(yǎng)殖場（戶）、公園、花鳥市場及幼兒園等場所飼養(yǎng)的禽及其他鳥類中，出現(xiàn)神經(jīng)癥狀或不明原因急性死亡的病例。

1.2 疑似病例

經(jīng)錦州市疫控中心使用H7N9 雙重熒光RTPCR 檢測為陽性，并經(jīng)遼寧省疫控中心使用H7N9雙重熒光RT-PCR 復檢為陽性的臨床懷疑病例。

1.3 確診病例

經(jīng)哈爾濱獸醫(yī)研究所國家禽流感參考實驗室確診為H7N9 流感病原學陽性的疑似病例。

2 調查方法

2.1 現(xiàn)場調查

采用現(xiàn)場勘察、訪談、問卷調查等形式，對該動物園內(nèi)飼養(yǎng)野禽的種類、數(shù)量以及禽舍布局、飼養(yǎng)管理模式、免疫情況、調入調出情況、園內(nèi)其他野生動物飼養(yǎng)管理情況等進行調查；通過與該縣（區(qū)）農(nóng)業(yè)農(nóng)村局、農(nóng)業(yè)發(fā)展服務機構疫病控制部門及動物衛(wèi)生監(jiān)督部門相關獸醫(yī)人員座談，了解疫點3 km 范圍內(nèi)的禽養(yǎng)殖場戶分布及其養(yǎng)殖、免疫等基本情況，以及禽交易市場、候鳥或野鳥活動等相關情況。

2.2 臨床觀察及剖檢

現(xiàn)場觀察園內(nèi)飼養(yǎng)的孔雀等野禽的臨床表現(xiàn)，并對死亡孔雀進行解剖，觀察病變情況。

2.3 樣品采集

2019年3月18日，采集動物園小禽舍內(nèi)病死孔雀喉頭、氣管、肺臟和肝臟等組織樣品，咽/泄殖腔雙拭子樣品以及同群活孔雀血清和雙拭子樣品共21 份；3月19日，采集鳴禽舍和水禽舍內(nèi)鳥類咽/泄殖腔雙拭子樣品以及環(huán)境糞便、飲水、飼料庫飼料和環(huán)境、禽舍防禽網(wǎng)糞便等樣品共70 份；4月3日，采集鳴禽舍和水禽舍內(nèi)存欄鳥類咽/泄殖腔雙拭子、環(huán)境水樣及糞便樣品30 份，采集疫點周邊3 km范圍內(nèi)禽飼養(yǎng)場戶、活禽交易場點、公園、花鳥魚市場及幼兒園內(nèi)的家禽或觀賞禽類咽/泄殖腔雙拭子、環(huán)境水樣和糞便樣品共551 份。

2.4 實驗室檢測

所有采集的組織、拭子、飲水等樣品，首先經(jīng)錦州市疫控中心實驗室采用熒光RT-PCR 方法進行禽流感病毒核酸檢測，陽性樣品送遼寧省疫控中心實驗室復檢，同時送哈爾濱獸醫(yī)研究所國家禽流感參考實驗室確診。發(fā)病期間采集的血清樣品，送遼寧省疫控中心實驗室進行抗體檢測。

2.5 數(shù)據(jù)分析

將調查數(shù)據(jù)資料分類錄入Excel，對相關數(shù)據(jù)進行分析。使用描述性流行病學方法進行疫情三間分布描述，繪制疫情流行曲線，并對疫情的風險因素來源、傳播方式等提出假設并驗證。

3 調查結果

3.1 基本情況

3.1.1 飼養(yǎng)情況 該動物園位于錦州市凌河區(qū)人民街5 段11 號（東經(jīng)121.139 359、北緯41.143 571），占地24.5 公頃，包括動物觀賞區(qū)13.8 公頃，其中野禽類館舍3 處，分別為鳴禽舍、水禽舍和小禽舍。各舍間相互獨立，鳴禽舍與水禽舍相鄰。發(fā)病死亡孔雀所在舍為小禽舍，位于園區(qū)的最里面，與鳴禽舍和水禽舍相距約100 m。禽舍飼料近3年來由同一個供應商供貨，從未更換；3 個禽舍飼喂同批飼料，最近一批飼料2019年2月初購入。各禽舍由不同飼養(yǎng)員負責飼喂管理，基本上不串舍；園內(nèi)有專職獸醫(yī)負責禽鳥的日常保健和診療。園內(nèi)存欄的禽類均為觀賞鳥類，未飼養(yǎng)家禽。發(fā)病前，3 個禽舍共存欄野禽394 只，其中小禽舍存欄200 只，包括孔雀155 只以及綠頭鴨、雁鵝、鴯鹋、鴕鳥和鴿子等其他野禽45 只。

3.1.2 免疫情況 2018年10月，使用禽流感H5+H7 亞型三價苗開展過1 次全園觀賞鳥類的集中免疫；2020年3月15日，再次使用禽流感H5+H7 亞型三價苗開展了1 次全園觀賞鳥類的集中免疫，免疫劑量為1 mL/只。

3.1.3 野禽購入及調出情況 經(jīng)查閱園內(nèi)禽鳥檔案，現(xiàn)場查看園內(nèi)禽鳥飼養(yǎng)情況及詢問園內(nèi)管理人員，確定該動物園2年內(nèi)未購入，也未售出觀賞鳥類。

3.1.4 周邊排查情況 發(fā)病舍周邊3 km 范圍內(nèi)涉及凌河區(qū)、古塔區(qū)、太和區(qū)共計17 個鄉(xiāng)（街道）、49 個村（社區(qū)），有中小型規(guī)模禽場6 個、花鳥魚蟲市場1 個，無活禽交易市場。其中的5 個禽場距疫點約3 km，1 個禽場距疫點約1.5 km，花鳥魚蟲市場距疫點約2 km；共存欄禽13.12 萬只，包括家雞、鴨、鵝、鵪鶉等12.1 萬只、鴿子0.87 萬只、其他觀賞鳥類0.15 萬只。經(jīng)排查，未發(fā)現(xiàn)異常情況。

3.2 臨床表現(xiàn)及剖檢癥狀

2019年3月18日，錦州市疫控中心專家現(xiàn)場調查發(fā)現(xiàn)，有1 只孔雀表現(xiàn)出明顯神經(jīng)癥狀，走路搖晃不穩(wěn)，翅膀觸地維持平衡，頭扭曲后揚，身體強直，并很快死亡。另據(jù)該動物園內(nèi)獸醫(yī)描述，3月17日發(fā)病死亡的孔雀中，也有1 只出現(xiàn)神經(jīng)癥狀并很快死亡。現(xiàn)場調查發(fā)現(xiàn)，該小禽舍內(nèi)剩余的孔雀和其他鳥類眼觀均正常，個別孔雀排綠色稀便。現(xiàn)場對3月17日和18日發(fā)病死亡的孔雀進行剖檢，僅見腸道有彌漫性出血，其他臟器均無肉眼可見病變。

3.3 三間分布

3.3.1 時間分布 2019年3月17日，該動物園小禽舍內(nèi)3 只孔雀急性發(fā)病死亡；3月18日，又有6 只孔雀急性發(fā)病死亡；3月18日，錦州市疫控中心專家進行現(xiàn)場診斷。經(jīng)過專家評估，立即對發(fā)病死亡孔雀所在小禽舍采取封鎖、消毒、隔離、撲殺和無害化處理等應急處置措施，對該禽舍內(nèi)剩余的191 只觀賞禽進行全群撲殺和無害化處理。本次暴發(fā)的時間分布曲線見圖1。

圖1 死亡病例發(fā)生的時間分布曲線

3.3.2 空間分布 該動物園內(nèi)飼養(yǎng)觀賞禽的場舍共有3 處，疫情僅局限在小禽舍內(nèi)（圖2）。距小禽舍約100 m 處的鳴禽舍和水禽舍內(nèi)飼養(yǎng)的丹頂鶴、白頭鶴、紅腹錦雞、赤麻鴨等觀賞鳥共194 只，臨床表現(xiàn)均正常。小禽舍位于動物園園區(qū)最里面，環(huán)境更為僻靜。該區(qū)域樹木密度最大，數(shù)量也較鳴禽舍和水禽舍周邊多很多。據(jù)園區(qū)管理人員觀察，該區(qū)域內(nèi)活動和棲息的野鳥明顯較另兩處禽舍周圍多，尤其在晚上。

圖2 發(fā)病禽舍空間分布

3.3.3 群間分布 本次暴發(fā)的襲擊率為4.5%（9/200），僅小禽舍內(nèi)飼養(yǎng)的孔雀發(fā)病死亡，同舍內(nèi)飼養(yǎng)的綠頭鴨、雁鵝、鴯鹋、鴕鳥和鴿子等其他觀賞鳥臨床表現(xiàn)均正常，其他2 棟禽舍內(nèi)觀賞鳥臨床表現(xiàn)也均正常。

3.4 實驗室檢測

3月18日，錦州市疫控中心對該動物園小禽舍內(nèi)采集的6 份樣品（病死孔雀臟器1 份、病死孔雀拭子3 份和同群活孔雀2 份拭子）進行了禽流感病毒核酸通用型及分型熒光RT-PCR 檢測，檢出H7N9 流感病毒核酸陽性6 份；3月19日，錦州市疫控中心對鳴禽舍、水禽舍、禽舍防禽網(wǎng)和飼料料庫內(nèi)采集的70份樣品進行了禽流感病毒核酸檢測，結果均為陰性；遼寧省疫控中心對錦州市疫控中心送檢的21 份樣品（3 份臟器、9 份拭子和9 份血清樣品）進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)3 份臟器、6 份拭子樣品為H7N9 流感病毒核酸陽性。血清樣品檢測結果顯示，H5 Re-8 抗體效價≥4log2 的9 份，H7 Re-2抗體效價為3log2 的5 份、2log2 的1 份、0log2 的3 份，均＜4log2，表明H5 抗體水平均合格，而H7 抗體水平均不合格；3月20日，12 份樣品（臟器3 份、拭子9 份）送至國家禽流感參考實驗室；3月23日，經(jīng)國家禽流感參考實驗室雞胚接種分離鑒定和基因序列分析，確診為高致病性H7N9 流感；4月3日，錦州市疫控中心對采自該動物園及周邊3 km 范圍內(nèi)的相關樣品共581 份進行了禽流感病毒核酸檢測，結果均為陰性。

4 病因假設與分析

4.1 通過遷徙野鳥帶毒傳入的風險最高

錦州市為遼寧省西南部渤海灣的重要港口城市，地理位置特殊，氣候溫和，處于全球最主要的9 條候鳥遷徙通路中最繁忙的第5 條東亞-澳大利亞遷徙通道及新發(fā)現(xiàn)的第9 條西太平洋候鳥遷徙通道交匯處的渤海灣瓶頸區(qū)域（圖3）。以錦州市的小凌河口、大凌河口及毗鄰的盤錦市遼河口、營口市大遼河口組成的渤海灣濱海濕地，是全球第三大、亞洲最大的原始野生濱海濕地。每年2月底開始，有200 多種數(shù)千萬只候鳥遷徙至此停歇、繁殖或越冬，到4月底或5月初離開。該動物園內(nèi)樹木茂密，林木覆蓋率達80%以上。除禽舍有防止園內(nèi)野禽外逃的防禽網(wǎng)外，園區(qū)內(nèi)無其他防野鳥設施。據(jù)動物園飼養(yǎng)員介紹，2月下旬以來，園內(nèi)一直有成群野鳥盤桓?，F(xiàn)場調查時也發(fā)現(xiàn)，有成群野鳥飛入、飛出園區(qū)。另據(jù)世界動物衛(wèi)生組織（OIE）通報，2019年1月以來，與錦州市同處兩條候鳥遷徙路線上的印度、巴基斯坦、越南、俄羅斯等我國周邊國家發(fā)生多起家禽及野鳥高致病性禽流感疫情。此外，禽流感抗體檢測結果表明，該發(fā)病舍內(nèi)的野鳥均未建立起有效的H7N9 流感免疫保護屏障。因此，遷徙野鳥帶毒傳入引發(fā)疫情的風險最高。

圖3 候鳥遷徙路線示意圖

4.2 飼料和飲水傳入的風險較低

園區(qū)觀賞鳥的飼料由料房統(tǒng)一配送，料房管理較為規(guī)范，野鳥、老鼠等進入可能性極?。粚︼暳蠋靸?nèi)飼料、環(huán)境和禽舍內(nèi)飲水抽樣進行了禽流感病毒核酸檢測，結果均為陰性。在后期解除封鎖前進行評估采樣監(jiān)測時，曾考慮是否由飼喂的猛獸飼料（主要為從固定的交易市場經(jīng)檢疫后購進的雞肉）帶毒傳入，但對飼料庫里5 份凍存雞肉和5 份冰箱和料庫環(huán)境樣品進行禽流感病毒核酸檢測，結果也均為陰性。因此，由飼料和飲水傳入的風險較低。

4.3 人員和車輛帶毒傳入的風險較低

園區(qū)觀賞鳥分別在3 個相對獨立的禽舍內(nèi)飼養(yǎng)，由各自飼養(yǎng)員負責。據(jù)陳述，2月份以來，飼養(yǎng)員均無與園外禽類接觸史；時值3月中旬，東北地區(qū)氣溫較低，加上該動物園規(guī)模不大，園內(nèi)動物品種數(shù)量不多，且近年來變化不大；進入園區(qū)的游客以周邊的居民帶著孩子參觀為主，外地游客極少。同時，該動物園禁止游客自帶食物飼喂動物，園區(qū)內(nèi)有專門售賣飼料的攤位，主要為小袋顆粒飼料和機制玉米卷，游客可以通過防禽網(wǎng)或籠子，飼喂園區(qū)觀賞鳥。另外，發(fā)病禽舍周邊3 km 范圍內(nèi)也無活禽交易市場，對周邊禽飼養(yǎng)場、環(huán)境等樣品進行禽流感病毒核酸檢測的結果也均為陰性。綜上，由人員帶毒傳入的風險較低。園區(qū)內(nèi)禁止外來車輛進入，僅園區(qū)配料車、綠化車等專用車輛通行，因此由外來車輛傳入的風險也較低。

5 疫情擴散風險

該動物園3月17日開始出現(xiàn)孔雀發(fā)病并死亡，3月18日錦州市疫控中心介入調查后，初步診斷為禽流感疫情，政府對園區(qū)立即采取了封鎖、消毒等控制措施。結合禽流感最長潛伏期為21 d的特征，追蹤調查期設為2月25日至園區(qū)實施封鎖。調查顯示，此期間內(nèi)該動物園內(nèi)無觀賞鳥調出，也未向園區(qū)外運出禽舍墊料、糞便等污染物，因此疫情由疫點向外擴散的風險較低。

6 疫情處置

3月18日，錦州市疫控中心介入調查后，通過臨床觀察、剖檢，結合現(xiàn)場流行病學調查，初步懷疑為禽流感疫情，遂對整個園區(qū)采取了隔離、消毒措施；3月19日凌晨，在采樣送遼寧省疫控中心復檢的同時，當?shù)卣凑铡陡咧虏⌒郧萘鞲蟹乐渭夹g規(guī)范》，對園區(qū)采取了嚴格的全面封鎖、消毒、隔離措施。通過風險評估確定小禽舍為疫點，并對疫點內(nèi)死亡及同群觀賞鳥全部撲殺并無害化處理；對園內(nèi)另兩處禽舍內(nèi)觀賞鳥、環(huán)境、飲水等開展緊急采樣檢測，每天對園區(qū)所有觀賞鳥進行臨床觀察、記錄，一旦有可疑情況立即報告；劃定疫點周邊3 km范圍為疫區(qū)，10 km 范圍為受威脅區(qū)，對疫區(qū)內(nèi)禽類養(yǎng)殖場戶、花鳥市場及其他相關場所進行了緊急排查并采樣檢測，對疫區(qū)及受威脅區(qū)所有禽類開展H7N9 流感緊急免疫。緊急免疫15 d 后，采樣進行禽流感免疫抗體評估和病毒核酸檢測，發(fā)現(xiàn)H5 和H7 抗體合格率均達到95%以上，禽流感病毒核酸均為陰性。4月9日，錦州市組織專家對疫點、疫區(qū)進行現(xiàn)場評估驗收，認為符合解除封鎖的規(guī)定，遂按照程序解除封鎖。至此，該起H7N9 流感疫情被徹底撲滅。

7 討論

本次疫情為國內(nèi)首次報道的一起孔雀高致病性H7N9 流感疫情。通過緊急流行病學調查并未找到確切的疫情傳入來源，但通過風險分析，綜合考慮疫情暴發(fā)時間、野鳥遷徙路線、周邊國家疫情情況、疫點周邊3 km 范圍內(nèi)禽類養(yǎng)殖場戶及其他相關場所的排查及檢測情況，推測疫情由遷徙野鳥帶毒傳入引發(fā)的風險較高。錦州市疫控中心從禽舍防禽網(wǎng)上及園區(qū)環(huán)境中采集的10 份鳥糞便拭子樣品中并未檢出禽流感病毒核酸，這可能與采樣時機不對、樣本數(shù)量不足等因素有關。因此，建議今后在野鳥遷徙季節(jié)，持續(xù)加強對遷徙野鳥的禽流感主動監(jiān)測，為禽流感的及時預警和制定精準防控措施，提供更為確實可靠的科學數(shù)據(jù)支撐。風險評估表明，病原由飼料、飲水、人員和車輛等傳入的風險較低，也排除由調入禽類傳入的可能。該園區(qū)內(nèi)未制定科學的禽流感免疫程序，未及時開展H7N9 流感疫苗免疫，導致園內(nèi)飼養(yǎng)禽類抗體水平未達到群體保護水平，這是該起疫情發(fā)生的內(nèi)在誘因。通過采取科學處置措施，并經(jīng)過排查和監(jiān)測評估，證實該起疫情未發(fā)生擴散，最終確定該起疫情被成功撲滅。

本次疫情提示，必須高度重視禽流感的強制免疫工作。禽類養(yǎng)殖場戶、觀賞鳥及花鳥市場等禽類養(yǎng)殖相關場所，應制定科學免疫程序，及時開展禽流感免疫工作，定期開展禽流感免疫抗體水平監(jiān)測和評估，并做好新生禽類的補免工作，保證禽流感免疫及時到位，確保不留免疫空檔期，使禽群持續(xù)保持堅實免疫屏障；同時禽類相關場所應建立生物安全體系，制定科學的生物安全防控措施，提高生物安全水平，做好防止野鳥進入以及人員管理、場所消毒、無害化處理等各項具體防控工作。