飼糧中添加蘋果渣對(duì)伊拉肉兔盲腸微生物多樣性的影響

馮國(guó)亮 鄭建婷 曹 亮 牛曉艷 李燕平 唐耀平 任克良

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，山西太原030032）

隨著我國(guó)蘋果產(chǎn)量的逐年增加，大量的蘋果渣被廢棄，對(duì)環(huán)境造成壓力。據(jù)研究蘋果渣富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，適口性好，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1]。優(yōu)質(zhì)粗飼料資源短缺長(zhǎng)期以來阻礙了家兔業(yè)的發(fā)展，合理利用蘋果渣不僅能變廢為寶，同時(shí)可以緩解家兔粗飼料資源短缺的難題，有利于家兔生產(chǎn)的健康發(fā)展。許多研究表明蘋果渣可以提高肉兔生長(zhǎng)性能，改善胃腸道環(huán)境，降低腹瀉率[2-3]。通過前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，添加適宜比例的蘋果渣可以顯著提高斷奶肉兔生長(zhǎng)性能，降低料肉比，提高肉兔對(duì)中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維的消化率，并且對(duì)兔肉品質(zhì)無(wú)不良影響[4]。相關(guān)研究同時(shí)表明，添加高水平的蘋果渣對(duì)粗蛋白質(zhì)消化率產(chǎn)生不利影響，但可提高粗纖維的消化率[5-8]。目前沒有添加蘋果渣對(duì)斷奶肉兔盲腸微生物影響的報(bào)道，為了更深入地研究蘋果渣對(duì)肉兔生產(chǎn)性能、養(yǎng)分利用的影響機(jī)制，從腸道微生物的角度探究蘋果渣對(duì)肉兔的影響，開展了添加不同水平的蘋果渣對(duì)肉兔盲腸菌群多樣性的影響，探討肉兔飼糧中蘋果渣的最適添加比例，為家兔生產(chǎn)中蘋果渣的合理利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用蘋果渣來自山東省煙臺(tái)市，其營(yíng)養(yǎng)成分見表1。試驗(yàn)兔為100只體重相近的32日齡斷奶伊拉肉兔。

表1 蘋果渣營(yíng)養(yǎng)成分含量（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.2 試驗(yàn)飼糧

參考我國(guó)建議的家兔營(yíng)養(yǎng)供給量[9]，選用玉米、豆粕、麩皮、蘋果渣、葵花皮等原料配制試驗(yàn)飼糧，飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表2。

表2 飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與試驗(yàn)兔飼養(yǎng)管理

選擇100 只健康的32 日齡的斷奶伊拉肉兔作為試驗(yàn)動(dòng)物，隨機(jī)分成5組，每組20個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1只兔。分別飼喂含不同水平蘋果渣（0、6%、12%、18%和24%）的飼糧。試驗(yàn)期為30 d。試驗(yàn)前對(duì)兔舍及試驗(yàn)用具進(jìn)行清洗，消毒；按照試驗(yàn)兔場(chǎng)常規(guī)免疫程序免疫接種。試驗(yàn)兔單籠飼養(yǎng)。兔舍自然采光、通風(fēng)。每日08：00、17:00進(jìn)行飼喂，自由飲水。

1.4 樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，每個(gè)試驗(yàn)組隨機(jī)采集5只試驗(yàn)兔的盲腸內(nèi)容物，裝入無(wú)菌的5 ml 凍存管中，迅速投入液氮中，隨后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存待測(cè)。

1.5 腸道微生物基因組提取及測(cè)序

使用環(huán)境樣本DNA提取試劑盒進(jìn)行基因組DNA抽提后，使用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA。隨后將DNA 樣品測(cè)序分析（由成都安諾微生物檢測(cè)公司完成），采用PE250測(cè)序方式，測(cè)序試劑盒使用Illumina 公司Hiseq Rapid SBS Kit v2 (FC-402-4023 500 Cycle)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

雙端測(cè)序得到的PE reads 首先使用FLASH 進(jìn)行拼接，使用QIIME 軟件將拼接之后的序列按照barcode 標(biāo)簽區(qū)分，去除低質(zhì)量序列，在97%的相似性水平上使用UPARSE 算法進(jìn)行操作分類單元OTU（Operational Taxonomic Units）的聚類，挑選出OTU的代表性序列。使用Uchime 去除嵌合體，并基于Silva 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU 進(jìn)行分類學(xué)注釋?；贠TU 聚類分析結(jié)果，使用QIIME、Mothur 和R 等軟件對(duì)樣本進(jìn)行Alpha 多樣性分析、Beta 多樣性分析和群落結(jié)構(gòu)的差異性分析。采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件的Anova 方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan's 法進(jìn)行多重比較，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果質(zhì)量分析

2.1.1 樣品測(cè)序結(jié)果

采用Illumina Hiseq 測(cè)序平臺(tái)對(duì)5 組盲腸內(nèi)容物樣本中16S rDNA基因的V4區(qū)進(jìn)行檢測(cè)，25個(gè)樣品測(cè)序共得到856 712 條長(zhǎng)度約316 bp 的序列，總堿基數(shù)270 720 992 bp。

2.1.2 各組試驗(yàn)兔盲腸微生物OTU的基礎(chǔ)分析

在97%的相似水平下對(duì)OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析，將5組樣品的有效序列進(jìn)行聚類，共得到2 010個(gè)OTU，5組OTU數(shù)目分別為1 301、1 358、1 149、1 217、1 231個(gè)。由圖1可知，5組共有OTU數(shù)目為693個(gè)，對(duì)照組與各試驗(yàn)組特有的OTU數(shù)目分別為174、228、43、47、42個(gè)。隨著蘋果渣添加水平的增加，對(duì)照組與各試驗(yàn)組共有OTU數(shù)從894個(gè)（97.68%）增加到951個(gè)（98.36%），并且對(duì)照組與Ⅲ組、Ⅳ組共有OTU數(shù)相對(duì)穩(wěn)定。

2.1.3 稀釋曲線

由圖2 可知，序列稀釋曲線（圖2 上）顯示并未達(dá)到飽和，但是Shannon 指數(shù)多樣性分析證明當(dāng)前的序列稀釋度已達(dá)到飽和（圖2下），結(jié)果表明樣品DNA中大部分多樣性的細(xì)菌已經(jīng)被獲得，所測(cè)的序列足以覆蓋群落物種組成，能夠真實(shí)反映群落各物種間的相對(duì)比例關(guān)系。

圖1 蘋果渣對(duì)肉兔盲腸微生物OTU的影響

圖2 所有樣品的Shannon指數(shù)與稀釋曲線

2.2 菌群多樣性分析

2.2.1 α多樣性分析

α多樣性是對(duì)單個(gè)樣品中物種多樣性的分析。樣品的Chao1值在生態(tài)學(xué)中常用來估計(jì)物種總數(shù)，Shannon指數(shù)用來估算樣本中微生物多樣性，數(shù)值越大，說明群落多樣性越高。Simpson指數(shù)常用來定量描述一個(gè)區(qū)域的生物多樣性，數(shù)值越高代表多樣性越高。由表3可知，盲腸內(nèi)微生物菌群的多樣性隨著蘋果渣添加量的增加呈現(xiàn)先降低再增加的趨勢(shì)，試驗(yàn)Ⅳ組多樣性最高。

2.2.2 β多樣性分析

對(duì)添加不同水平蘋果渣后試驗(yàn)兔盲腸微生物群落進(jìn)行PCoA 分析（見圖3）和非度量多維尺度分析（NMDS）（見圖4），用來研究各樣本群落組成的差異性，圖中不同顏色或形狀的點(diǎn)代表不同的樣本。圖中各樣品點(diǎn)之間距離越近，表明樣本之間微生物群落構(gòu)成越相似，差異越小。由圖3、圖4 可知，試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組樣本之間聚集度較高，說明添加適量的蘋果渣對(duì)試驗(yàn)兔盲腸微生物群落構(gòu)成差異影響不大。

2.3 菌群結(jié)構(gòu)和組成

表3 盲腸微生物α多樣性指標(biāo)

圖3 試驗(yàn)兔盲腸微生物群落構(gòu)成的PCoA圖

圖4 試驗(yàn)兔盲腸微生物群落構(gòu)成的NMDS圖

表4 試驗(yàn)兔盲腸微生物群落在門水平上的分布(%)

2.3.1 不同蘋果渣添加水平，在門的分類水平上試驗(yàn)兔盲腸微生物的變化

由表4可知，25只試驗(yàn)兔盲腸微生物均主要由厚壁菌門（Firmicutes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、擬桿菌門（Bacteroidetes）及變形菌門（Proteobacteria）這四種菌門組成。5個(gè)組這4種菌門共占盲腸微生物的比例達(dá)到98.83%、98.31%、99.03%、99.06%和99.08%，且添加不同比例的蘋果渣與對(duì)照組相比，各菌門相對(duì)豐度差異均不顯著（P＞0.05)。在本試驗(yàn)中，各組試驗(yàn)兔盲腸微生物中相對(duì)豐度最大的優(yōu)勢(shì)菌門為厚壁菌門。

2.3.2 不同蘋果渣添加水平，在科的分類水平上對(duì)試驗(yàn)兔盲腸微生物的影響

圖5 是科水平上25 只試驗(yàn)兔盲腸微生物構(gòu)成的柱狀圖。在科水平上，試驗(yàn)兔盲腸微生物中瘤胃菌科、疣微菌科、毛螺旋菌科、克里斯滕森菌科、擬桿菌目S24-7群和弧菌科相對(duì)豐度較高。結(jié)果顯示，添加不同比例的蘋果渣與對(duì)照組相比，各菌科相對(duì)豐度差異均不顯著（P＞0.05)。但隨著蘋果渣添加量的增加，毛螺旋菌科(P=0.059 7)與克里斯滕森菌科(P=0.076 4)的相對(duì)豐度有增加的趨勢(shì)。

圖5 科水平上試驗(yàn)兔盲腸微生物群落結(jié)構(gòu)分布

2.3.3 不同蘋果渣添加水平，在種屬水平上試驗(yàn)兔盲腸微生物豐度及差異性分析

以種屬分類水平上豐度大于1%作為優(yōu)勢(shì)菌屬的劃分依據(jù)[10]。如表5 所示，對(duì)照組及不同試驗(yàn)組試驗(yàn)兔盲腸內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌屬分別為16、16、15、17、16 種。對(duì)照組與各試驗(yàn)組之間有顯著差異的菌屬共有兩種，均屬于厚壁菌門，其中一種毛螺菌科未定義菌屬，以試驗(yàn)Ⅳ組最高，顯著高于對(duì)照組及其他試驗(yàn)組（P＜0.05）；試驗(yàn)Ⅱ組、Ⅳ組瘤胃球菌科UCG-010 屬的相對(duì)豐度極顯著高于對(duì)照組和試驗(yàn)Ⅰ組（P＜0.01）；添加蘋果渣對(duì)其他菌屬相對(duì)豐度沒有顯著影響（P＞0.05）。

3 討論

近幾年，我國(guó)蘋果產(chǎn)量逐年增高，2017 年我國(guó)蘋果年產(chǎn)量達(dá)到世界蘋果總產(chǎn)量的57%。伴隨著蘋果加工業(yè)的迅速發(fā)展，大量蘋果渣廢棄后對(duì)環(huán)境造成很大的影響，據(jù)統(tǒng)計(jì)，每加工1 000 kg 鮮蘋果可產(chǎn)生150～200 kg蘋果渣。蘋果渣主要包含果皮、果核和殘余果肉，因此營(yíng)養(yǎng)豐富、適口性好，同時(shí)蘋果渣含有豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物、可溶性糖及有機(jī)酸、維生素、礦物質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)成分，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值頗高[11]。其含有的酸性物質(zhì)可以調(diào)節(jié)幼年動(dòng)物胃內(nèi)pH，刺激胃腺，從而改善胃內(nèi)環(huán)境，提高胃內(nèi)消化液的分泌，促進(jìn)胃腸道對(duì)養(yǎng)分的消化、吸收，有利于幼年動(dòng)物的健康。盲腸微生物群落是在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中形成的，與宿主保持相對(duì)平衡的穩(wěn)定狀態(tài)，宿主和微生物菌群的平衡共生可促進(jìn)動(dòng)物機(jī)體的健康、提高生產(chǎn)性能，打破平衡就容易導(dǎo)致腸道疾病發(fā)生[12-13]。因此有必要對(duì)添加蘋果渣對(duì)伊拉肉兔盲腸微生物的影響進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

近年來，高通量測(cè)序成為研究盲腸微生物多樣性的主要手段。本試驗(yàn)通過測(cè)序結(jié)果表明，添加蘋果渣對(duì)試驗(yàn)兔盲腸微生物群落構(gòu)成差異影響不大，在門水平上，相對(duì)豐度最大的優(yōu)勢(shì)菌門為厚壁菌門，其次是疣微菌門、擬桿菌門及變形菌門，這與許多研究家兔盲腸微生物的結(jié)果相一致[14-17]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，添加蘋果渣提高了擬桿菌門的比例，降低了變形菌門的比例。擬桿菌是家兔腸道中主要有益菌[18]，變形菌門是細(xì)菌中最大的一門，雖然在盲腸微生物群落中占的比例很小，但其包括很多病原菌，如本試驗(yàn)測(cè)序得到的與腸道炎癥有關(guān)的脫硫弧菌屬、嗜膽菌屬及大腸桿菌等[19]。Wilkowska等[20]通過體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，添加蘋果渣可以減弱病原菌對(duì)小腸細(xì)胞的附著。本試驗(yàn)中隨著蘋果渣添加水平的增加，變形菌門豐度先減少后增加，這與前期飼養(yǎng)試驗(yàn)中隨著蘋果渣添加量的增加，試驗(yàn)兔腹瀉率先降低后升高的結(jié)果相一致[4]。由此推測(cè)，飼糧中添加蘋果渣，可能會(huì)通過影響變形菌門中一些病原菌的豐度，從而對(duì)肉兔腸道健康造成影響。在科水平上，各試驗(yàn)組盲腸微生物均以瘤胃菌科、毛螺旋菌科相對(duì)豐度最高，隨著蘋果渣添加量的增加，毛螺旋菌科與克里斯滕森菌科的相對(duì)豐度有增加的趨勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn)，克里斯滕森菌科受宿主遺傳背景影響很大，其可顯著影響小鼠體內(nèi)脂肪代謝[21]，蘋果渣對(duì)這一菌科的影響還有待于進(jìn)一步的研究。毛螺旋菌科是盲腸內(nèi)參與發(fā)酵的主要菌，具有降解半纖維素的能力[22]。在屬水平上，與對(duì)照組相比，一種毛螺旋菌科未定義菌屬的比例隨著蘋果渣添加水平的增加而增加，以試驗(yàn)Ⅳ組最高，顯著高于其他組，因此添加蘋果渣對(duì)這個(gè)未定義菌屬比例的顯著影響還有待于進(jìn)一步的研究。另外，添加一定比例的蘋果渣瘤胃球菌科UCG-010 屬的比例極顯著增加，以第Ⅳ組最高。前人的研究表明，瘤胃菌科微生物與纖維降解密切相關(guān)，是一類典型的纖維降解菌[23]。張雪嬌等[24]研究發(fā)現(xiàn)，隨著飼糧NDF 水平的增加，山羊瘤胃菌科微生物的增殖加強(qiáng)，進(jìn)而證實(shí)瘤胃菌科微生物與瘤胃纖維降解密切相關(guān)。Patra 等[25]研究也證實(shí)瘤胃菌科微生物的比例與纖維降解能力顯著相關(guān)，這些研究均與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

表5 不同蘋果渣添加水平試驗(yàn)兔盲腸微生物群落在屬水平上的分布(%)

4 結(jié)論

飼糧中添加蘋果渣可以改變生長(zhǎng)肉兔盲腸中一些具有發(fā)酵功能的菌屬的豐度，從而影響生長(zhǎng)肉兔盲腸微生物的多樣性。蘋果渣作為一種優(yōu)質(zhì)粗飼料資源，在本試驗(yàn)條件下，添加24%的蘋果渣對(duì)伊拉肉兔盲腸微生物無(wú)不利影響。