ABTS自由基顯色分光光度法測(cè)定酵素中的黃酮

王明瑞, 侯彥喜, 葉 超

(1.開封大學(xué) 材料與化學(xué)工程學(xué)院，河南 開封 475000；2.開封市發(fā)酵食品工程技術(shù)研究中心，河南 開封 475000)

以水果、蔬菜、藥材等為原料經(jīng)過發(fā)酵得到的酵素產(chǎn)品中，除了含有原料中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)成分外，還增加了有機(jī)酸、氨基酸、蛋白酶、胞外糖等次生代謝產(chǎn)物[1-4].因此，酵素具有調(diào)理腸胃、促進(jìn)機(jī)體消化吸收、抗氧化、提高免疫力等功效[5].研究證明黃酮類物質(zhì)具有較強(qiáng)的清除自由基的能力[6-7].目前，常采用色譜法[8-10]和分光光度法[11-13]測(cè)定黃酮含量.在分光光度法中，常用的檢測(cè)體系有Al(NO3)3-NaNO2-NaOH法和AlCl3-NaAc法，存在檢測(cè)限較高、操作相對(duì)復(fù)雜、不適合微量黃酮檢測(cè)等缺點(diǎn)[14-17].本文采用ABTS自由基體系顯色法測(cè)定食品中的黃酮[18-19]，用于檢測(cè)酵素中存在的黃酮，嘗試為食品類樣品檢測(cè)黃酮類物質(zhì)建立一種快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蕓香葉苷(盧丁)(含量≥99.0%，分析純)：酷爾化學(xué)科技(北京)有限公司； ABTS(2,2-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二胺鹽)：美國(guó)Sigma公司；超純水：由DZG-303A艾科浦超純水機(jī)制得；亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁、過硫酸鉀均為分析純：天津市福晨化學(xué)試劑廠.

番茄、馬齒莧酵素系列產(chǎn)品由開封市蘭考相關(guān)企業(yè)生產(chǎn)提供.

1.2 儀器與設(shè)備

US/VIS 1800PC紫外可見分光光度儀：上海美譜達(dá)公司；ADVENTURERTMPRO 分析天平：美國(guó)OHAUS有限公司；HH-1恒溫水浴鍋：常州市金壇區(qū)西城新瑞儀器；DHG-9023A電熱鼓風(fēng)干燥箱：安徽塔蘭特儀器科技有限公司；SHB-IIIA循環(huán)水式真空泵：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；DB-4電熱板：常州市金壇區(qū)環(huán)宇科學(xué)儀器廠；KQ-250DA型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司.

1.3 蘆丁和ABTS+·相互作用體系光譜圖繪制

1.3.1 蘆丁和ABTS+·相互作用光譜圖

選用3只10 mL容量瓶編號(hào)分別為 1、2、3.精密吸取10 g/L蘆丁對(duì)照品溶液2.0 mL，100 g/L ABTS+·溶液2.0 mL；精密吸取10 g/L蘆丁對(duì)照品溶液2.0 mL；精密吸取100 g/L ABTS+·溶液2.0 mL；分別加超純水定容到10.00 mL.三組溶液均以空白超純水作參比，在波長(zhǎng)300～700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，得到對(duì)應(yīng)光譜圖.

1.3.2 ABTS+·體系中，改變蘆丁增加量的光譜圖

選用5只10 mL容量瓶編號(hào)分別為 0、1、2、3、4.準(zhǔn)確加入100 g/L ABTS+·溶液2.0 mL后，分別加不同量的蘆丁溶液(0、0.50、1.00、1.50與2.00 mL)，加水定容到10.00 mL.以不加蘆丁的溶液的0號(hào)為參比，在波長(zhǎng)300～700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，得到對(duì)應(yīng)光譜圖.

1.3.3 ABTS+·體系中，加入番茄酵素、馬齒莧酵素后光譜圖

選用5只10 mL容量瓶編號(hào)分別為 0、1、2、3、4.前3只準(zhǔn)確加入100 g/L ABTS+·溶液2.0 mL后，分別加入蒸餾水2.00 mL，番茄稀釋液2.00 mL，馬齒莧稀釋液2.00 mL，搖勻后，加水定容到10.00 mL.3、4號(hào)容量瓶分別加入番茄稀釋液2.00 mL，馬齒莧稀釋液2.00 mL，加水定容到10.00 mL.以蒸餾水為參比，在波長(zhǎng)300～700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，得到對(duì)應(yīng)光譜圖.

1.4 黃酮測(cè)定條件優(yōu)化

1.4.1 反應(yīng)溫度

準(zhǔn)確加入100 g/L ABTS+·溶液2.0 mL后，加入10.0 g/L蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00 mL，搖勻后，加水定容到10.00 mL.在10、15、20、25、30、35與40 ℃水浴中反應(yīng)15 min.以相同條件下不添加蘆丁的ABTS+·溶液為參比，在337 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度.

1.4.2 反應(yīng)時(shí)間及體系穩(wěn)定性的確定

準(zhǔn)確加入100 g/L ABTS+·溶液2.0 mL后，加入10.0 g/L蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00 mL，搖勻后，加水定容到10.00 mL.在室溫條件下，靜置2、3、5、10、15、20、30與40 min，以相同條件下不添加蘆丁的ABTS+·溶液為參比，在337 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度.

1.4.3 試劑用量的確定

分別加入100 g/L ABTS+·溶液(0、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50與3.00 mL)，再準(zhǔn)確加入10.0 g/L蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液2.0 mL后，搖勻后，加水定容到10.00 mL.靜置15 min，以蒸餾水為參比，在337 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度.

1.5 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

選用9只10 mL容量瓶編號(hào)分別為 0～8.準(zhǔn)確加入100 g/L ABTS+·溶液2.0 mL后，分別加不同量的10.0 g/L蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液(0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75與2.00 mL)，搖勻后，加水定容到10.00 mL.靜置15 min，以不加蘆丁的0號(hào)溶液為參比，在337 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度.以蘆丁質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標(biāo)，吸光度值(A)為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.6 樣品及回收率測(cè)定

準(zhǔn)確吸取番茄、馬齒莧發(fā)酵液提取液10.00 mL于容量瓶中，加入亞鐵氰化鉀溶液3 mL和乙酸鋅溶液3 mL，至不再產(chǎn)生沉淀為止，定容至100 mL，放置片刻，過濾靜置 30 min，用干燥濾紙過濾，棄初濾液，取后續(xù)濾液備用.

準(zhǔn)確吸取番茄儲(chǔ)備液10.00 mL加入超純水定容到100.00 mL(稀釋10倍)，馬齒莧儲(chǔ)備液5.00 mL加入超純水定容到100.00 mL(稀釋20倍).

準(zhǔn)確加入100 g/L ABTS+·溶液2.0 mL后，分別加番茄稀釋液2.00 mL，馬齒莧稀釋液1.00 mL，搖勻后，加水定容到10.00 mL.靜置10 min，以不加樣品的空白溶液為參比，在337 nm 處測(cè)定吸光度.

吸取番茄儲(chǔ)備液10.00 mL，加入1.00 mL 100 mg/L 蘆丁溶液加入超純水定容到100.00 mL，按照上述操作測(cè)定，進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn).

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁和ABTS+·自由基相互作用的紫外可見吸收光譜研究

2.1.1 蘆丁和ABTS+·相互作用光譜圖

根據(jù)1.3.1的操作方法繪制蘆丁與ABTS+·、ABTS+·、蘆丁吸收光譜圖.以蒸餾水為參比，在波長(zhǎng)300～700 nm范圍內(nèi)逐一進(jìn)行光譜掃描，每隔1 nm采集吸光度值，結(jié)果如圖1.

圖1 蘆丁和ABTS+·光譜掃描圖Fig.1 UV visible absorption spectra of rutin and ABTS+· radicals

由圖1可知，2.0 mg/L蘆丁溶液在300～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)沒有明顯吸收.20 mg/L的ABTS+·溶液在300～700 nm范圍內(nèi)有多個(gè)吸收峰.在415 nm處有一個(gè)ABTS+·穩(wěn)定的吸收峰，在345 nm處的吸收峰強(qiáng)度略大于415 nm處的吸收峰，吸光度值接近0.6.在加入蘆丁溶液后可以看出，在415 nm處的吸收峰明顯降低，在345 nm附近吸收峰卻明顯增強(qiáng).混合體系的吸收峰穩(wěn)定在337 nm處.此處吸收峰不是蘆丁和ABTS+·溶液吸收峰的簡(jiǎn)單加和，因此，可以利用此吸收峰來測(cè)定蘆丁的含量.

2.1.2 ABTS+·體系中，改變蘆丁增加量的光譜分析

根據(jù)1.3.2的操作方法繪制不同蘆丁加入量時(shí)，體系的吸收光譜圖.實(shí)驗(yàn)中以不加入蘆丁的空白溶液為參比，在波長(zhǎng)300～700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，每隔1 nm采集吸光度值，結(jié)果如圖2所示.由圖2可知，隨蘆丁樣品濃度的增加，在415 nm處的吸收峰明顯降低，337 nm處的吸收峰呈增加趨勢(shì)，因此在369 nm處形成一個(gè)等吸收點(diǎn).在此波長(zhǎng)處，體系吸光度不隨著蘆丁加入量的改變而改變.隨著蘆丁濃度的增大，337 nm處的吸光度增加幅度減弱，分析原因ABTS+·用量不足，造成回歸方程的相關(guān)系數(shù)降低.根據(jù)415 nm吸光度減少，337 nm處吸光度增加，分別進(jìn)行數(shù)據(jù)測(cè)定，并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，337 nm處相關(guān)系數(shù)(R2=0.997 8)>415 nm處相關(guān)系數(shù)(R2= 0.995 2).因此，實(shí)驗(yàn)中選擇337 nm作為ABTS自由基體系檢測(cè)蘆丁含量的檢測(cè)波長(zhǎng).

圖2 不同濃度的蘆丁溶液與ABTS+· 的光譜圖Fig.2 Spectrogram of Rutin solution with different concentrations and ABTS+·

2.1.3 ABTS+·體系中，加入番茄酵素、馬齒莧酵素后的光譜分析

根據(jù)1.3.3的操作方法繪制番茄酵素、馬齒莧酵素溶液與ABTS+·作用體系的吸收光譜圖.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示.

由圖3可知，檢測(cè)范圍內(nèi)的番茄酵素溶液和馬齒莧酵素溶液本身在300～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)沒有明顯吸收，加入ABTS+·后，混合體系在337 nm處的吸收峰增加顯著.因此，實(shí)驗(yàn)中選擇337 nm作為ABTS自由基體系檢測(cè)番茄酵素溶液和馬齒莧酵素溶液中黃酮含量的檢測(cè)波長(zhǎng).

圖3 酵素溶液與ABTS+·作用的光譜圖Fig.3 Spectrogram of fermentation extract solution and ABTS+·

2.2 檢測(cè)條件優(yōu)化結(jié)果分析

2.2.1體系溫度

體系溫度對(duì)吸光度的影響如圖4所示.由圖4可知，反應(yīng)溫度升高，體系吸光度上升不明顯.經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)試發(fā)現(xiàn)，溫度高時(shí)，工作曲線的線性變差，因此實(shí)驗(yàn)時(shí)選定測(cè)試溫度為室溫20 ℃.

圖4 反應(yīng)溫度對(duì)吸光度的影響Fig.4 Effects of temperature on absorbance

2.2.2 反應(yīng)時(shí)間與體系穩(wěn)定性

按照1.4.2操作，研究反應(yīng)時(shí)間和反應(yīng)體系的吸光度穩(wěn)定性，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制圖譜.試劑加入3 min后，體系的吸光度趨于穩(wěn)定，在一個(gè)小時(shí)內(nèi)吸光度受時(shí)間變化影響可以忽略.所以根據(jù)實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果，在溶液配制完成后，選擇靜置15 min，再進(jìn)行吸光度檢測(cè).

2.2.3 體系酸度

通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在弱酸環(huán)境中，體系吸光度不受酸度變化影響.本實(shí)驗(yàn)所用試劑為中性或者弱酸性(酵素一般是弱酸性，pH不高于4).經(jīng)檢測(cè)，本實(shí)驗(yàn)使用反應(yīng)體系溶液在3.8～4.5之間，因此在實(shí)驗(yàn)過程中不再加入緩沖溶液控制溶液的pH.

2.2.4 試劑用量

ABTS+·用量對(duì)檢測(cè)體系有重要影響，結(jié)果如圖5所示.實(shí)驗(yàn)中，保持蘆丁的用量不變，不斷增加ABTS+·用量，可以看出在337 nm處吸收峰增加，在415 nm處吸收峰逐漸顯現(xiàn).415 nm處是ABTS+·的吸收峰，可以反映出ABTS+·剩余量.使用0.5 mL的ABTS+· 溶液(圖中曲線1)，1.0 mL ABTS+·溶液(圖中曲線2)在415 nm處的吸光度接近0，說明蘆丁使ABTS+·完全轉(zhuǎn)化，此時(shí)ABTS+·用量是不足的.進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究表明在低濃度的ABTS+·溶液中，測(cè)定低濃度的蘆丁回歸方程的線性良好，當(dāng)蘆丁濃度增大時(shí)回歸方程的線性明顯降低.進(jìn)一步證明了ABTS+·用量不足.另一方面，當(dāng)增加ABTS+·用量時(shí)，ABTS+·自身在337 nm處吸收增大，將會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確性.因此本實(shí)驗(yàn)選用ABTS+·濃度為100 mg/L,用量為2 mL.

圖5 ABTS+·用量對(duì)吸光度的影響Fig.5 Effects of ABTS+·on absorbance

2.3 工作曲線及樣品測(cè)定

按照1.5的操作方法，以蘆丁質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標(biāo)，吸光度值(A)為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線,如圖6所示.由圖6可知，實(shí)驗(yàn)測(cè)定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：A= 0.269 3ρ+0.000 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 98，研究表明蘆丁在0～2.00 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，最低檢測(cè)限為 0.04 mg/L.

圖6 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of Rutin

按照1.5的操作，計(jì)算番茄原液中黃酮含量為630.1 mg/L，馬齒莧發(fā)酵液中黃酮含量為2 513 mg/L.

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn)

取同批次稀釋100倍的番茄發(fā)酵稀釋液，按上述確定的檢測(cè)條件在波長(zhǎng)337 nm處連續(xù)測(cè)定6次吸光度值.測(cè)定結(jié)果分別為0.339 6、0.337 4、0.337 6、0.340 2、0.341 2、0.341 8，RSD為 0.54%，低于2%，說明儀器精密度良好.番茄發(fā)酵液、馬齒莧發(fā)酵試液的黃酮含量測(cè)定結(jié)果及精密度測(cè)試數(shù)據(jù)見表1.分析數(shù)據(jù)可知，儀器和方法精密度良好，滿足化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證的技術(shù)要求.

表1 番茄、馬齒莧酵素發(fā)酵液中黃酮含量

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn)

選擇不同批次稀釋100倍的番茄發(fā)酵稀釋液，按1.6操作測(cè)定6次吸光度值.對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，RSD值為1.37%，低于2%，說明此顯色法測(cè)定酵素溶液中的黃酮的重復(fù)性良好.

2.4.3 回收率試驗(yàn)

番茄酵素中黃酮回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果列于表2 中.由表2可知，在番茄酵素中添加蘆丁標(biāo)液檢測(cè)平均回收率在98.2%，RSD值小于2%，證明該方法對(duì)蘆丁的回收性良好，該方法準(zhǔn)確度良好.

表2 番茄酵素中黃酮回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.4 與分析方法測(cè)定結(jié)果的比較

采用Al(NO3)3-NaNO2-NaOH法檢測(cè)番茄、馬齒莧發(fā)酵液中的黃酮含量，重復(fù)測(cè)定5次，取其平均值.與ABTS+·顯色體系測(cè)定結(jié)果進(jìn)行對(duì)比.研究表明，采用2種方法測(cè)定番茄、馬齒莧發(fā)酵液中的黃酮含量結(jié)果基本一致，相對(duì)偏差都小于3%，說明2種方法檢測(cè)結(jié)果無顯著性差異.說明本方法在測(cè)定發(fā)酵液中的黃酮時(shí)方法可靠.

3 結(jié)論

本研究分析ABTS+·溶液加入黃酮類后，在337 nm處的吸光度顯著增加，再對(duì)測(cè)定條件進(jìn)行考察，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定兩種酵素溶液中的黃酮含量.根據(jù)測(cè)定結(jié)果分析可知，番茄、馬齒莧兩種酵素發(fā)酵液中黃酮含量(以蘆丁存在形式計(jì)量)分別為630.1、2 513 mg/L.由此可知番茄和馬齒莧在發(fā)酵后溶液中可測(cè)定的黃酮上升顯著.

通過方法比較、準(zhǔn)確度及精密度分析，建立了可同時(shí)、批量測(cè)定酵素樣品中黃酮類物質(zhì)新的紫外可見分光光度法.研究表明此方法操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)迅速、檢測(cè)限低，適合樣品中微量黃酮的測(cè)定.