七氟醚通過靶向miR-203調控ERK/MMP-9通路抑制結直腸癌細胞的遷移和侵襲

何世華 尚曉寧 苗良生

結直腸癌(CRC)是全球范圍內最常見的具有高轉移性的惡性腫瘤之一。七氟醚是1種揮發(fā)性麻醉劑，據報道其在非小細胞肺癌和腎癌的轉移中具有重要的調控作用[1]。microRNAs(miRNAs)是一類具有21～25個核苷酸的小型非編碼RNA，它們對CRC的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學過程具有重要的作用。此外，研究發(fā)現miRNAs參與多種癌癥中七氟醚介導的生物學過程。如miR-637通過調節(jié)蛋白激酶B途徑介導七氟醚對神經膠質瘤細胞遷移和侵襲的作用[2]。miR-203作為一種腫瘤抑制因子，可調控非小細胞肺癌的增殖、遷移和侵襲[3]，而且miR-203也介導七氟醚對乳腺癌細胞增殖的調控[4]。本文旨在研究七氟醚對CRC細胞遷移和侵襲的影響，并探討miR-203在其中的調控作用。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)及干預方式

人CRC細胞系SW620購自美國ATCC公司。將細胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清及雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，與37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞匯合度達到90%以上時，進行傳代培養(yǎng)，每隔2～3天換一次培養(yǎng)基。取第3～5代生長穩(wěn)定的細胞用于后續(xù)試驗。

將細胞以每孔5×105個細胞(1 ml/孔，5×105/ml)接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，隨機分為2組：對照組和七氟醚組，n=4。將培養(yǎng)板置于密閉容器中，于37 ℃恒溫水浴鍋中，密閉容器進氣口連接麻醉機，通入氣體。采用氣體檢測儀監(jiān)測通入七氟醚的濃度。七氟醚組通入4%的七氟醚、5% CO2～95% O2，對照組通入5% CO2～95% O2，氣體流量均為1 μl/min，持續(xù)通入6 h。然后細胞在進行常規(guī)培養(yǎng)24 h。

1.2 劃痕實驗

將2組處理后的細胞制備成細胞懸液并計數，以1×106個/皿的濃度將細胞接種于60 mm的小皿中，培養(yǎng)過夜。用無菌的200 μl的槍頭在垂直于細胞生長方向劃痕，用預冷的PBS洗3次，繼續(xù)于37 ℃培養(yǎng)48 h后，在倒置顯微鏡下拍照。計算遷移速率(m/h)=(0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度)/48 h。

1.3 Transwell細胞侵襲實驗

將用無血清培養(yǎng)基配制的Matrigel膠預先平鋪于Transwell上、下小室之間。將2組處理好的細胞用無血清培養(yǎng)基制備成細胞懸液并計數。取2×105/ml個細胞200 μl加入Transwell上小室中，下小室中充滿含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)24 h后，用4%多聚甲醛室溫固定20 min，0.1%結晶紫室溫染色20 min，200光鏡下計數，隨機選取10個視野，統計細胞數。

1.4 Western Blot

采用RIPA裂解液從各組細胞中提取總蛋白，BCA試劑盒進行總蛋白定量分析。將20 g的總蛋白加入上樣緩沖液，用10%的SDS-PAGE凝膠分離，轉膜至PVDF膜上，用5%的胎牛血清封閉45 min，于4 ℃孵育一抗過夜，TBST洗3次，室溫搖床孵育二抗1 h，TBST洗3次，用電化學發(fā)光試劑ECL暗室發(fā)光。采用凝膠成像系統和Image J軟件統計分析條帶。β-actin為內參，p-ERK、ERK、β-actin抗體及二抗均購自上海碧云天公司，MMP-9、Robo1抗體購自美國Abcam公司。

1.5 實時熒光定量PCR

采用TriZol試劑從各組細胞中提取總RNA，用M-MLV反轉錄酶合成第一鏈cDNA，用SYBR green熒光染料進行定量PCR擴增。根據2-Ct公式計算目的基因的相對表達量，miR-203的內參用U6，Robo1的內參用β-actin。引物由Primer designing tool軟件設計，由上海生工生物工程公司合成。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 七氟醚對CRC細胞遷移能力的影響

如圖1所示，七氟醚組的細胞遷移速率(7.995±0.165)m/h顯著低于對照組的細胞遷移速率(4.07±0.17)m/h。

圖1 2組細胞遷移能力對比

2.2 七氟醚對CRC細胞侵襲的影響

如圖2所示，七氟醚組穿透Matrigel基質膠的細胞數[(95.496±5.502)個]，顯著低于對照組[(48.391±3.605)個]。

2.3 七氟醚對CRC細胞ERK/MMP-9通路的影響

如表1所示，與對照組相比，七氟醚組p-ERK和MMP-9的表達顯著降低(P<0.05)，而七氟醚組ERK的表達無顯著變化。

2.4 七氟醚對CRC細胞miR-203及其靶基因的影響

如圖3所示，根據TargetScan在線軟件的預測結果，miR-203可與Robo1 3’UTR端結合，且在Robo1 3’UTR端有2個結合位點550～557和1441～1448。如表2所示，qRT-PCR及Western Blot結果顯示，與對照組相比，七氟醚組miR-203的表達顯著增加(P<0.05)，而Robo1 mRNA和Robo1蛋白的表達顯著降低(P<0.05)。

圖2 2組細胞侵襲能力對比

表1 2組ERK/MMP-9通路分子表達對比

表2 2組miR-203及其靶基因表達的對比

3 討論

在體外研究中，七氟醚可影響非小細胞肺癌、腎癌和神經膠質瘤等多種癌細胞的轉移潛能[1,5]，因此本研究試圖探討七氟醚對CRC細胞遷移和侵襲的影響，劃痕實驗和Transwell侵襲實驗表明4%七氟醚可顯著抑制CRC細胞的遷移和侵襲。這與Xu等的研究一致，七氟醚可抑制結腸癌細胞的增殖和侵襲，誘導其凋亡[6]。ERK信號參與七氟醚調控的多種生物學過程[7]，因此我們推測七氟醚可能通過ERK途徑抑制CRC細胞的遷移和侵襲，為了驗證此推測，我們檢測2組中p-ERK和ERK蛋白的表達，結果發(fā)現七氟醚可顯著抑制p-ERK蛋白的表達，而對ERK蛋白的表達無顯著影響，這些結果提示七氟醚可抑制ERK通路的活性，進一步證明七氟醚可通過阻斷ERK途徑抑制CRC的遷移和侵襲。

miR-203在多種癌癥中即可作為致癌因子，也可作為抑癌因子。例如miR-203作為致癌因子促進卵巢癌的生長及遷移[8]。但是目前越來越多的研究報道m(xù)iR-203作為抑癌因子參與CRC的發(fā)展過程，例如miR-203可通過調節(jié)真核起始因子5A2抑制CRC細胞的增殖、遷移和侵襲[9]，此外miR-203也可通過調節(jié)鋅指蛋白217抑制CRC細胞的增殖、遷移和侵襲[10]。這樣相反的作用效果可能是由于腫瘤環(huán)境的不同造成的。之前的研究也建議miRNAs的失調與七氟醚的調節(jié)有關[2,4]，本研究也發(fā)現七氟醚可顯著上調CRC細胞中miR-203的表達，這也符合之前的報道，七氟醚通過上調miR-203的表達抑制乳腺癌細胞的增殖[6]。此外，在胃癌中miR-203和ERK通路之間也有潛在的調節(jié)作用[11]。因此我們推測ERK通路的激活與七氟醚上調miR-203進而抑制CRC的遷移和侵襲有密切的關系。當然詳細的信號通路研究還有進一步開展，如miR-203阻斷或者ERK通路阻斷是否對七氟醚調控的CRC細胞遷移和侵襲有影響作用。

據報道MMPs在癌細胞的遷移、生長、炎癥等過程中具有至關重要的調節(jié)作用。MMP-9參與肌醇六磷酸刺激的CRC細胞的遷移和侵襲過程有關[12]，而且ERK通路有助于MMP-9誘導多種癌癥轉移[13]。因此我們推測MMP-9可能也參與七氟醚對CRC細胞的調節(jié)過程，通過對本研究2組細胞中MMP-9表達的檢測發(fā)現，七氟醚可顯著抑制MMP-9的表達。結合之前的文獻報道，我們推測七氟醚通過阻斷ERK通路，進而抑制MMP-9的表達，最終抑制CRC細胞的遷移及侵襲。MMP-9是1種蛋白水解酶，其主要功能是降解細胞外基質中的Ⅳ型、Ⅴ型膠原和明膠，促進腫瘤的侵襲和轉移能力[14]。因此七氟醚抑制CRC細胞遷移和侵襲的機制可能與阻斷ERK通路，進而抑制MMP-9介導的細胞外基質降解有關。

功能性miRNAs可通過與特定mRNA的3′-UTR端結合并調節(jié)此mRNA的表達。在骨肉瘤中Robo1與ERK通路有密切的關系[15]，而且據報道m(xù)iR-203可在神經膠質瘤細胞中可靶向Robo1和ERK/MMP-9通路[16]。因此我們推斷Robo1可能是miR-203的下游靶點，參與調節(jié)七氟醚對CRC細胞遷移和侵襲的影響。通過TargetScan在線軟件軟件分析顯示，miR-203可與Robo1 3’UTR端的2個位點550～557和1441～1448結合。而且七氟醚可顯著抑制Robo1 mRNA和Robo1蛋白的表達。這些研究及結果提示，miR-203可通過靶向Robo1的3’UTR端，抑制Robo1的表達，進而參與七氟醚對CRC細胞遷移和侵襲的調控。且miR-203/Robo1對ERK/MMP-9通路的調控可能是此過程的分子機制。本研究還有一些不足之處，例如對分子機制的探討還不夠徹底、缺乏動物實驗的研究，另外目前認為腫瘤干細胞是多種癌癥(包括CRC)治療失敗、轉移及復發(fā)的源頭，七氟醚是否對腫瘤干細胞也有同樣的調節(jié)作用是我們將來要研究的內容之一。

圖3 miR-203及其靶基因Robo1結合位點的預測圖

總之，本研究表明七氟醚可抑制CRC細胞的遷移和侵襲，機制可能與其調控miR-203/Robo1的表達，進一步阻斷ERK/MMP-9通路有關。