快速凝膠熒光染色法在尿液蛋白電泳分析中的應(yīng)用

賈 佳， 潘 婕， 倪 軍， 王 森， 徐志曄， 柏 兵

（南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇 南京 210008）

尿蛋白變化通常是腎臟或其他臟器系統(tǒng)實(shí)質(zhì)性損傷或功能性改變的反映。目前，在臨床實(shí)驗(yàn)室中一般僅檢測尿總蛋白水平[1]，但這不能反映出尿蛋白的選擇性情況。實(shí)際上，在腎小球?yàn)V過增加、腎小管重吸收減少以及腎小球、腎小管損傷釋放或主動分泌等條件下，尿蛋白都會升高，并且在尿蛋白成分上出現(xiàn)一定的特征性。因此，除尿蛋白水平外，其成分分析對病因判斷具有重要意義。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）是蛋白成分分析的常用手段[2]，但由于考馬斯亮藍(lán)染色液在靈敏度上的局限性，制約了SDSPAGE在尿液樣本蛋白分析中的應(yīng)用。SYPRO Ruby是一種可與蛋白結(jié)合的熒光染料，用于凝膠染色時(shí)，具有很高的靈敏度及較廣的線性范圍[3]。本研究利用這種新型染料對SDS-PAGE后的尿蛋白樣本進(jìn)行染色，并作初步研究。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集2018年10月南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院37例腎臟疾病患者的尿液，其中男20例、女17例，年齡21～72歲。另收集同期南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院8例系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）患者（SLE組，均為女性，年齡18～45歲）的尿液，與5名女性體檢健康者（正常對照組）的尿液作對比。

1.2 方法

1.2.1 樣本的收集和處理 留取所有對象的清潔中段尿。采用AU5800全自動生化分析儀（美國Beckman Coulter公司）檢測尿液總蛋白水平，試劑盒購自南京厄爾尼醫(yī)學(xué)科技有限公司。在尿液標(biāo)本中加入4×LDS加樣緩沖液（美國ThermoFisher Scientific公司）及10 mmol/L二硫蘇糖醇（1，4-dithiothreitol，DTT）（美國Sigma-Aldrich公司），80 ℃加熱10 min后，冰上靜置1 min，20 000×g離心3 min。將1.3 g/L尿蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（德國DiaSys Diagnostic Systems GmbH公司）用1×LDS加樣緩沖液進(jìn)行倍比稀釋，按上述方法處理，上樣量為10 μL，10個(gè)孔道中的最終蛋白加樣量分別為5 000.0、2 500.0、1 250.0、625.0、312.5、156.0、78.0、39.0、20.0、10.0 ng。

1.2.2 凝膠準(zhǔn)備與SDS-PAGE 取商品化蛋白質(zhì)電泳預(yù)制膠（ExpressPlus PAGE Gel，4%～12%；南京金斯瑞生物技術(shù)公司），按說明書要求進(jìn)行電泳。樣本量較多時(shí)，自備增寬凝膠。

1.2.3 考馬斯亮藍(lán)染色液染色 參照考馬斯亮藍(lán)R250染色液（含10%乙酸、50%甲醇，美國Bio-Rad公司）說明書，將已進(jìn)行過電泳的凝膠染色過夜，蒸餾水脫色至條帶清晰，拍照保存。

1.2.4 常規(guī)凝膠熒光染色 將凝膠用去離子水清洗3～5次，用固定液（50%甲醇和7%醋酸）固定30 min，再用去離子水清洗3～5次，用SYPRO Ruby染色液（美國ThermoFisher Scientific公司）浸泡，輕輕搖動，室溫下避光過夜。用10%甲醇與7%醋酸的混合液清洗3次，再用清水清洗3次，拍照保存，并將圖像背景調(diào)為黑色，蛋白條帶為灰色。

1.2.5 快速凝膠熒光染色 本研究參照SYPRO Ruby染色液說明書及文獻(xiàn)[4]，對染色方法進(jìn)行了改進(jìn)。采用快速凝膠熒光染色法，染色時(shí)間縮短至15 min。具體步驟：電泳結(jié)束后，將用去離子水預(yù)洗后的凝膠放入預(yù)熱至90 ℃的去離子水中清洗3次，然后放入預(yù)熱至90 ℃的熒光染液中染色15 min，再用常溫去離子水漂洗3遍，顯像拍照，將蛋白條帶結(jié)果與染色過夜的蛋白條帶結(jié)果進(jìn)行比較。

1.3 圖像處理

采用Image J軟件（美國國立衛(wèi)生研究院）對凝膠上的蛋白條灰度進(jìn)行定量。由于2種凝膠的條帶顏色不同，其灰度值不能直接比較，所以分別以各自的第1個(gè)尿液樣本的灰度為基準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2種方法間的比較采用雙因素方差分析和post-hoc Tukey檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 SYPRO Ruby染色液染色的靈敏度

尿蛋白標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋并進(jìn)行SDS-PAGE后分別采用SYPRO Ruby染色液和考馬斯亮藍(lán)染色液進(jìn)行染色。與考馬斯亮藍(lán)染色液染色結(jié)果相比，SYPRO Ruby染色液染色后的凝膠上可見更多清晰的蛋白條帶。當(dāng)尿蛋白標(biāo)準(zhǔn)品加樣量為39.0 ng時(shí)，考馬斯亮藍(lán)染色液染色已無明顯條帶，見圖1（a）。當(dāng)尿蛋白標(biāo)準(zhǔn)品加樣量為10 ng時(shí)，SYPRO Ruby染色液染色的主要蛋白（疑似白蛋白）條帶依然可見，見圖1（b）。

分別測定2種染色方法染色后的疑似白蛋白條帶的灰度值并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。結(jié)果顯示，SYPRO Ruby染色液染色后的疑似白蛋白條帶灰度值高于考馬斯亮藍(lán)染色液染色，見圖1（c）。

用1例慢性腎炎患者的尿液樣本進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果與尿蛋白標(biāo)準(zhǔn)品一致，見圖2。

圖1 尿蛋白標(biāo)準(zhǔn)品SYPRO Ruby染色液染色與考馬斯亮藍(lán)染色的比較

圖2 慢性腎炎患者尿液樣本SYPRO Ruby染色與考馬斯亮藍(lán)染色液染色的比較

2.2 SDS-PAGE和SYPRO Ruby染色液染色在不同腎臟疾病患者尿液樣本分析中的應(yīng)用

對37例腎臟疾病患者的尿液樣本進(jìn)行SDSPAGE和SYPRO Ruby染色液染色。結(jié)果顯示，不同腎臟疾病患者之間尿蛋白成分有明顯的特征性變化，同種疾病患者尿蛋白成分不完全相同。見圖3。

對總蛋白濃度無明顯升高的SLE患者尿液標(biāo)本進(jìn)行SDS-PAGE和SYPRO Ruby染色液染色分析。SLE組尿液標(biāo)本中大部分蛋白條帶與對照組一致，但在相對分子質(zhì)量100 000處出現(xiàn)了一根較濃的蛋白條帶。見圖4。

圖3 不同腎臟疾病患者尿液樣本的SDS-PAGE和SYPRO Ruby染色液染色分析

圖4 SLE組與對照組尿液樣本的SDS-PAGE和SYPRO Ruby染色液染色分析

2.3 快速凝膠熒光染色法與染色過夜的蛋白條帶顯色比較

將尿液總蛋白濃度正常的患者尿液樣本分為2份，1份用快速凝膠熒光染色法進(jìn)行15 min快速染色，1份染色過夜。與染色過夜的蛋白條帶相比，快速凝膠熒光染色法顯色較弱。見圖5。

圖5 快速凝膠熒光染色法與染色過夜的蛋白條帶顯色比較

3 討論

本研究采用SDS-PAGE和SYPRO Ruby染色液染色對尿液蛋白成分進(jìn)行分析，并以此為基礎(chǔ)建立了快速凝膠熒光染色法，通過高溫加熱將染色時(shí)間縮短至15 min，這為快速凝膠熒光染色法在臨床的常規(guī)開展提供了可能。本方法可檢測到10 ng尿蛋白（加樣量為10 μL），即可檢測到1 ng/μL的尿液蛋白，可滿足臨床對尿液樣本的檢測要求。

本研究結(jié)果顯示，相同腎臟疾病的不同患者之間的尿液蛋白成分不太一致，即使尿總蛋白濃度正常，其蛋白成分卻可能已經(jīng)發(fā)生了變化，說明尿蛋白成分可能與腎臟的病因關(guān)系較小，與腎臟損傷和功能狀況有更為密切的關(guān)系，提示尿蛋白成分分析對腎臟損傷和功能變化具有重要價(jià)值。本研究結(jié)果顯示，尿總蛋白正常的SLE組尿液標(biāo)本中大部分蛋白條帶與對照組一致，但在相對分子質(zhì)量100 000處出現(xiàn)了一根較濃的蛋白條帶。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，推測該條帶可能為尿調(diào)節(jié)素蛋白[5-6]。本方法不僅可以協(xié)助更好地判斷蛋白尿的選擇性，還可以發(fā)現(xiàn)更多異常出現(xiàn)的蛋白。

綜上所述，以SDS-PAGE和SYPRO Ruby染色液染色為基礎(chǔ)的快速凝膠熒光染色法在尿液蛋白分析中具有重要價(jià)值，可作為尿蛋白分析的常規(guī)方法，為疾病的診治提供更多的信息。