衛(wèi)生行業(yè)與醫(yī)藥行業(yè)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)檢出限的異同解析

朱嶺峰， 葛丹紅， 方慧玲， 朱宇清

（上海市臨床檢驗(yàn)中心，上海 200126）

中國合格評(píng)定國家認(rèn)可委員會(huì)（China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNAS）CNAS-CL02-A004：2018《醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力認(rèn)可準(zhǔn)則在臨床免疫學(xué)定性檢驗(yàn)領(lǐng)域的應(yīng)用說明》[1]中明確指出：定性檢驗(yàn)方法和程序的分析性能驗(yàn)證內(nèi)容應(yīng)參考試劑盒說明書明確標(biāo)示的性能參數(shù)，至少應(yīng)包括檢出限（limit of detection，LoD）和符合率（采用國家標(biāo)準(zhǔn)血清盤或臨床診斷明確的陰、陽性樣品各20份，或與其他分析方法比對(duì)）。性能驗(yàn)證和方法學(xué)確認(rèn)一直是臨床實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理的重要內(nèi)容。目前，在臨床實(shí)驗(yàn)室、體外診斷試劑說明書及各類學(xué)術(shù)論文中，LoD仍有使用混亂的現(xiàn)象。我們就相關(guān)的術(shù)語及概念進(jìn)行初步解析。

1 醫(yī)藥行業(yè)和衛(wèi)生行業(yè)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中空白限（limit of blank，LoB）的區(qū)別

我國醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY/T 1183-2010《酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)試劑（盒）》[2]中，LoD的定義為：樣品中以一定概率可被聲明與零有差異的被測(cè)量的最低值。并在定義下有3個(gè)注釋[2]：（1）也被描述為“最低檢出限”（或計(jì)量或值）；（2）有時(shí)被不正確地稱為分析靈敏度；（3）本標(biāo)準(zhǔn)中的最低LoD為區(qū)別于零的不低于95%可信區(qū)間的最低濃度。這與國際理論和應(yīng)用化學(xué)聯(lián)合會(huì)（the International Union of Pure and Applied Chemistry，IUPAC）對(duì)LoD的定義——給定分析程序具有適當(dāng)?shù)拇_定檢出分析物的最小濃度和量[3]一致。IUPAC規(guī)定若LoD的分析信號(hào)為Xd，則Xd=xB+k·sB，并建議k（可靠性系數(shù)）取3，xB、sB分別為有限測(cè)量次數(shù)的空白均值和空白標(biāo)準(zhǔn)差。YY/T 1183-2010規(guī)定定量檢出方法學(xué)確認(rèn)的試驗(yàn)方法為：用零濃度校準(zhǔn)品或者樣本稀釋液作為樣本進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)測(cè)定20次，得出20次測(cè)量結(jié)果的吸光度（A）值，計(jì)算其平均值（M）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD），得出M+2SD（如果原理為競(jìng)爭(zhēng)法，則為M-2SD）所對(duì)應(yīng)的A值，根據(jù)試劑盒所用的校準(zhǔn)品的定標(biāo)曲線方程或者根據(jù)零濃度校準(zhǔn)品和相鄰校準(zhǔn)品之間的濃度-A值結(jié)果進(jìn)行兩點(diǎn)回歸擬合，得出一次方程，將M+2SD所對(duì)應(yīng)的A值帶入方程，求出對(duì)應(yīng)的濃度值，即為L(zhǎng)oD[2]。這一計(jì)算過程與IUPAC的區(qū)別僅僅是系數(shù)2和3，即95%可信區(qū)間和99.7%可信區(qū)間的區(qū)別。故可以認(rèn)為YY/T 1183-2010中LoD的定義就是源自于化學(xué)領(lǐng)域的概念。

我國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS/T 514-2017《臨床檢驗(yàn)方法檢出能力的確立和驗(yàn)證》（簡(jiǎn)稱514文件）[4]中，“檢出限”的定義為：給定測(cè)量程序獲得的測(cè)得值，其聲稱的物質(zhì)成分不存在的誤判概率為β，聲稱的物質(zhì)成分存在的誤判概率為α。并在定義下有2個(gè)注釋：（1）國際理論和IUPAC推薦的α和β的默認(rèn)值為0.05；（2）也被稱作檢測(cè)低限、最小可檢測(cè)濃度（值），縮寫為L(zhǎng)oD。

514文件中LoB的定義為：測(cè)量空白樣本時(shí)可能觀察到的最高測(cè)量結(jié)果[4]。在定義下有1個(gè)注釋：并非樣本中實(shí)際被測(cè)物的濃度。LoB也被稱作凈狀態(tài)變量臨界值。514文件中規(guī)定根據(jù)空白標(biāo)本測(cè)量結(jié)果分布選擇數(shù)據(jù)分析方法，非參數(shù)統(tǒng)計(jì)方法沒有分布要求，適用于所有的數(shù)據(jù)集；如空白標(biāo)本的測(cè)量結(jié)果呈方差齊性則應(yīng)采用參數(shù)統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算LoB，計(jì)算公式為：LoB=MB+CPSDB，式中MB為空白標(biāo)本的均值，SDB為空白標(biāo)本的標(biāo)準(zhǔn)差，CP為正態(tài)分布第95百分位數(shù)的乘數(shù)因子——用觀察SD代替真實(shí)未知人群SD的校準(zhǔn)因子，計(jì)算公式為1.645/[1-1/4（B-K）]，式中B為數(shù)據(jù)集空白結(jié)果的總數(shù)，K為空白標(biāo)本數(shù)。

從定義上來看，衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中LoB的定義與醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中LoD的定義接近，計(jì)算公式本質(zhì)是一致的，即空白標(biāo)本的均值加上不同倍數(shù)的空白標(biāo)本的標(biāo)準(zhǔn)差，這2個(gè)公式僅是系數(shù)不同（分別為2和CP）。原因是衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)考慮了2個(gè)因素：低水平和空白樣本結(jié)果的分布未必呈對(duì)稱和正態(tài)分布；低水平和空白樣品的重復(fù)檢查結(jié)果未必是具有結(jié)果相近的標(biāo)準(zhǔn)差。故我們認(rèn)為從定義和計(jì)算公式上來說，醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中的LoD相當(dāng)于衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中的LoB。

514文件中LoD的計(jì)算公式（參數(shù)統(tǒng)計(jì)）為：LoD=LoB+CPSDL，式中LoB為測(cè)量程序的空白限，SDL為低值標(biāo)本結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差，CP為正態(tài)分布第95百分位數(shù)的乘數(shù)因子——用觀察SD代替真實(shí)未知人群SD的校準(zhǔn)因子，計(jì)算公式為1.645/[1-1/4（L-J）]，式中L為所有低值標(biāo)本結(jié)果的總數(shù)，J為低值標(biāo)本數(shù)。由這2個(gè)公式可推導(dǎo)出LoD＞LoB。

醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中的LoD源自化學(xué)領(lǐng)域，在某些分析化學(xué)中對(duì)空白樣品做重復(fù)檢測(cè)并計(jì)算均值和標(biāo)準(zhǔn)差，然后將均值和數(shù)倍標(biāo)準(zhǔn)差相加（一般為2～3倍），即得到LoD。這個(gè)方法的缺點(diǎn)是無法區(qū)分現(xiàn)有的和真實(shí)的（或?qū)嶋H的）濃度，也混淆了一個(gè)事實(shí)，即實(shí)際處在LoD真實(shí)濃度的樣品（以化學(xué)方法確定的LoD），將只有50%的可能性能得到該值，說明存在著分析物[5]。故該方法得到的值一定是低于使用衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中LoD（較嚴(yán)格的統(tǒng)計(jì)方式）的值，也可以說是衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中LoB和LoD的濃度差。

同時(shí)，衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于LoD的計(jì)算方式有多種，除參數(shù)統(tǒng)計(jì)方法外，還有非參數(shù)統(tǒng)計(jì)方法、精密度曲線方案及概率單位方案，用于不同的數(shù)據(jù)、實(shí)驗(yàn)及檢測(cè)方法。

2 醫(yī)藥行業(yè)文件中LoD、衛(wèi)生行業(yè)文件中LoB和CNAS文件中臨界值的關(guān)系

CNAS 2019年發(fā)布的CNAS—GL038：2019《臨床免疫學(xué)定性檢驗(yàn)程序性能驗(yàn)證指南》（簡(jiǎn)稱GL038）未給出LoD的具體定義，但文件中關(guān)于臨界值的驗(yàn)證的計(jì)算方案為：選擇健康人和其他標(biāo)志物陽性患者的新鮮血清樣本各30份，分3～5批在3～5 d內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算平均值（M）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。臨界值驗(yàn)證值為M+3SD，若該驗(yàn)證值不大于說明書提供的臨界值（或者在說明書提供的臨界值±20%內(nèi)），則驗(yàn)證通過[6]。這相當(dāng)于醫(yī)藥行業(yè)文件中的LoD、衛(wèi)生行業(yè)文件中的LoB。故可以認(rèn)為CNAS文件中的臨界值、醫(yī)藥行業(yè)文件中的LoD、衛(wèi)生行業(yè)文件中的LoB三者的含義是相同的，且CNAS文件的內(nèi)容更類似臨界值的方法學(xué)確認(rèn)而非性能驗(yàn)證。

3 LoB、LoD、C50濃度、C95濃度、臨界值之間的關(guān)系

GL038未給出LoD的具體定義，但其驗(yàn)證方式為：使用定值標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的樣本梯度稀釋至廠商聲明的LoD濃度，樣本總數(shù)不得少于20個(gè)。如果≥95%的樣本檢出陽性，LoD驗(yàn)證通過[6]。514文件中的LoD驗(yàn)證的內(nèi)容為：保證檢測(cè)結(jié)束時(shí)有足夠的測(cè)量結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，至少應(yīng)包括20個(gè)低值標(biāo)本結(jié)果；計(jì)算低值測(cè)量結(jié)果等于或超過LoD聲明的百分比；將得到的百分比與附錄E的臨界值比較，如果沒有匹配的測(cè)量結(jié)果總數(shù)（N），選擇最接近的值；如果觀察百分比大于或等于附錄E中的值，則驗(yàn)證成功[4]?？梢钥闯?，2個(gè)文件的驗(yàn)證方式大體一致，其主要區(qū)別是514文件中規(guī)定了不同標(biāo)本結(jié)果數(shù)對(duì)應(yīng)臨界值觀察比例不同，例如20個(gè)結(jié)果對(duì)應(yīng)臨界值觀察比例為85%，30結(jié)果對(duì)應(yīng)臨界值觀察比例為87%。我們認(rèn)為兩者的LoD的性能驗(yàn)證的實(shí)質(zhì)內(nèi)容是一致的，但514文件中規(guī)定的限值更為合理，通過查表可知當(dāng)標(biāo)本結(jié)果數(shù)為1 000個(gè)時(shí)對(duì)應(yīng)的臨界值觀察比例為94%，故將任一≥20個(gè)的標(biāo)本結(jié)果的限值都規(guī)定為95%是不合理的。

我國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS/T 494-2017《臨床定性免疫檢驗(yàn)重要常規(guī)項(xiàng)目分析質(zhì)量要求》[7]（簡(jiǎn)稱494）和WS/T 505-2017《定性測(cè)定性能評(píng)價(jià)指南》[8]（簡(jiǎn)稱505）2個(gè)文件中有關(guān)于臨床免疫學(xué)定性檢驗(yàn)程序中臨界值、LoD的相關(guān)定義。首先，505文件定義：臨界點(diǎn)或值在定性試驗(yàn)中，臨界點(diǎn)是指檢測(cè)反應(yīng)的某一點(diǎn)，低于此檢測(cè)反應(yīng)點(diǎn)的定性檢測(cè)結(jié)果被判定為陰性，而高于此點(diǎn)則被判定為陽性[8]。494文件僅定義了臨界值濃度（C50）：處于或接近臨界值的分析物濃度，多次重復(fù)檢測(cè)此濃度的單一樣本時(shí)將獲得50%的陽性結(jié)果和50%的陰性結(jié)果[7]。這一定義與505文件中C50濃度的定義完全相同。我們認(rèn)為衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中臨界值與C50濃度是有區(qū)別的。首先，505文件中明確表示試劑生產(chǎn)廠家根據(jù)檢測(cè)目的及臨床敏感性和特異性建立臨界濃度，且一旦確立，用戶不可隨意更改。而C50濃度是通過Wilson計(jì)分可信區(qū)間法估計(jì)出的濃度（在實(shí)際操作中不易獲得50%陽性、50%陰性的結(jié)果，故利用統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法估計(jì)了C50濃度，在40次的重復(fù)實(shí)驗(yàn)中有14～26次陽性則C50濃度驗(yàn)證通過），所以C50濃度應(yīng)是圍繞著臨界值有無限個(gè)濃度值，在理想條件下C50濃度等于臨界值，即50%陽性、50%陰性。故臨界值具有唯一性，而C50濃度值具有不確定性。盡管有著定義上的不同（為了實(shí)驗(yàn)室用戶注意到在實(shí)際重復(fù)性研究中，廠家定義的臨界值和方法評(píng)價(jià)時(shí)估計(jì)的C50之間的差異會(huì)導(dǎo)致定性測(cè)定的偏差），但是不可否認(rèn)臨界值與C50濃度在數(shù)值上應(yīng)很接近，而CNAS文件中并未將這2個(gè)概念加以區(qū)分，這可能與檢測(cè)系統(tǒng)重復(fù)性良好而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室用戶難以確定C50濃度有關(guān)。其次，衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)“定義和術(shù)語”中均未對(duì)LoD定義，但494文件指出：檢測(cè)限是指檢測(cè)方法可檢測(cè)出的最低被測(cè)量濃度，也稱檢測(cè)低限或最小檢出濃度，有時(shí)也被稱為分析靈敏度。分析物濃度位于C5～C95區(qū)間之外（＜C5或＞C95）時(shí)，候選方法對(duì)同一樣本的重復(fù)性檢測(cè)將得到相同結(jié)果。因此，C95代表了某一試劑可以測(cè)出的最低被測(cè)量濃度[7]。在定性項(xiàng)目中（這里的定性是指只有陽性、陰性或者有反應(yīng)、無反應(yīng)），這是合理的，但在定量項(xiàng)目中，無論是醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中LoD的定義，還是和514文件中定量檢出限（LoQ）和功能靈敏度（FS）的定義都是有差異的。在定量項(xiàng)目中聲稱的物質(zhì)成分存在的誤判概率為0.05和定性項(xiàng)目中C95即有95%被檢樣品可被判定為陽性時(shí)的分析物濃度其定義是相一致的，即C95濃度相當(dāng)于LoD。

在衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)與CNAS文件的定義中，空白限和檢出限分別用LoB和LoD表示，但醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中，因?yàn)槠涠x來自于化學(xué)領(lǐng)域，LoD的定義相當(dāng)于衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)與CNAS中的LoB。然而醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)作為國內(nèi)體外診斷試劑的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，產(chǎn)品的申報(bào)、注冊(cè)很有可能按此標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，同時(shí)，醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定體外診斷試劑必須有LoD的聲明。故如果體外診斷試劑廠商在說明書中聲稱的LoD相當(dāng)于衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中的LoB，同時(shí)CNAS要求實(shí)驗(yàn)室必須驗(yàn)證定性項(xiàng)目的LoD，即廠商聲明了一個(gè)50%陽性、50%陰性可能性的濃度，而實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室需要驗(yàn)證一個(gè)85%（或95%）陽性的濃度，給實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行相關(guān)的性能驗(yàn)證帶來困難。各文件中LoD、LoB對(duì)應(yīng)的含義見表1。

表1 各文件中檢出限對(duì)應(yīng)的含義

4 討論

面對(duì)上述情況，我們認(rèn)為實(shí)驗(yàn)室首先需要了解清楚各體外診斷試劑廠商在說明書中聲明的LoD是否與衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和CNAS文件中的要求一致，同時(shí)體外診斷試劑廠商應(yīng)積極配合實(shí)驗(yàn)室提供申報(bào)產(chǎn)品時(shí)確認(rèn)LoD的方案，如果一致，實(shí)驗(yàn)室可直接按衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和CNAS文件中性能驗(yàn)證的方案完成驗(yàn)證；如果不一致，該LoD為醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中的LoD，即衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和CNAS中的LoB，按前文所述其實(shí)質(zhì)是定性檢測(cè)的臨界值，同時(shí)上文已經(jīng)提到，GL038文件并未區(qū)分臨界值和C50的區(qū)別，且505文件也認(rèn)為C50濃度應(yīng)當(dāng)很接近臨界值，故可以認(rèn)為此時(shí)廠商是提供了一個(gè)C50濃度，而衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和CNAS文件中要求驗(yàn)證的濃度為C95濃度（LoD），從505和494文件中可知C50+20%濃度應(yīng)該包含C95濃度，所以只需將廠商聲明的濃度增加20%即為所需檢測(cè)限，然后再檢測(cè)該濃度的樣本20次，陽性率＞相應(yīng)的限值即可完成驗(yàn)證。需要注意的是，如果該定性項(xiàng)目有定量方法學(xué)的支持或者國際參考品、國家參考物質(zhì)的支持，那么可以通過上述方式比較輕松地獲得C50+20%的濃度值，但是如果該方法沒有這個(gè)條件，那么獲得C50+20%的濃度值將比較困難，因?yàn)镃50濃度對(duì)應(yīng)的檢測(cè)值(不論是S/CO值、A值或者發(fā)光值) 與C50+20%濃度對(duì)應(yīng)的檢測(cè)值之比不等于C50濃度值（絕對(duì)濃度）與C50+20%濃度值之比(因?yàn)槲礈p去空白濃度且未考慮線性的情況)，此時(shí)只能通過將1個(gè)陽性樣品做一系列等比例稀釋至C50濃度，再通過這一系列的稀釋比例來確定C50+20%濃度，如：將陽性樣本做1∶2、1∶4、1∶8稀釋，然后通過檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)1∶8為C50濃度，此時(shí)只需4份1∶8加上1份的1∶4混合就獲得了C50+20%濃度(即包含C95濃度)。需要注意的是，目前全自動(dòng)分析儀的重復(fù)性與與傳統(tǒng)的手工酶免檢測(cè)比較有了質(zhì)的飛躍，但同時(shí)也使確定C50濃度變得困難（良好的重復(fù)性導(dǎo)致40次檢測(cè)結(jié)果相當(dāng)?shù)囊恢?，很難出現(xiàn)14～26次陽性的情況），建議使用臨界值附近濃度的檢測(cè)結(jié)果作為C50濃度，然后再按上述流程完成檢測(cè)限的驗(yàn)證。

在定量檢測(cè)項(xiàng)目中LoD并非必須完成的性能驗(yàn)證項(xiàng)目，但對(duì)于促甲狀腺激素、肌鈣蛋白等項(xiàng)目卻有非常重要的意義。同時(shí)在定性項(xiàng)目中LoD作為反應(yīng)檢測(cè)靈敏度的重要性能指標(biāo)，是必須完成的性能驗(yàn)證項(xiàng)目。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)重視檢測(cè)限的性能驗(yàn)證工作，充分理解其含義，以便更好地為臨床診斷服務(wù)。