血清醛固酮候選參考測(cè)量程序的建立及性能評(píng)估

鄒繼華， 李全樂(lè)， 沈 敏， 張 曼， 楊曉東， 屠敏敏， 馮東方， 孫宏娜

（1. 美康生物參考實(shí)驗(yàn)室，浙江 寧波 315104；2. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100038；3. 西藏軍區(qū)總醫(yī)院檢驗(yàn)科，西藏 拉薩 850007）

醛固酮是人體內(nèi)調(diào)節(jié)血容量的激素，通過(guò)調(diào)節(jié)腎臟對(duì)鈉離子的重吸收，維持水鹽平衡[1]。準(zhǔn)確測(cè)定血清醛固酮對(duì)于原發(fā)性醛固酮增多癥（primary aldosteronism，PA）的篩查、診斷和亞型評(píng)估至關(guān)重要[2]，血清醛固酮還可用于診斷腎上腺偶發(fā)瘤、腎上腺癌、艾迪生病、先天性腎上腺增生、腎臟動(dòng)脈狹窄和腎小管通道病變[3]。因此，準(zhǔn)確測(cè)定血清醛固酮水平對(duì)于正確診斷內(nèi)分泌疾病至關(guān)重要。血清醛固酮水平一般為pmol級(jí)別，對(duì)檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度和靈敏度有很高的要求。目前用于醛固酮測(cè)定的放射免疫分析法（radioimmunoassay，RIA）和化學(xué)發(fā)光免疫分析法存在缺乏特異性、基質(zhì)效應(yīng)及分析物動(dòng)態(tài)范圍有限等問(wèn)題[4-5]。因此，需要一種更加靈敏、準(zhǔn)確的方法來(lái)獲得可靠的檢測(cè)結(jié)果。氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）[6]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[7]是目前靈敏度和準(zhǔn)確性最好的方法。在測(cè)定類固醇激素時(shí)，GC-MS的樣本前處理需要進(jìn)行復(fù)雜的衍生化，而LC-MS/MS的前處理步驟更加簡(jiǎn)便，耗時(shí)短，靈敏度高，更能滿足臨床需求。目前，檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)溯源性聯(lián)合委員會(huì)（the Joint Committee for Traceability in Laboratory Medicine，JCTLM）列出了2種血清醛固酮參考方法[6，8]，分別由德國(guó)臨床化學(xué)學(xué)會(huì)和比利時(shí)根特大學(xué)建立，均采用GC-MS，以同位素稀釋質(zhì)譜法為測(cè)量原理，樣本前處理時(shí)需要衍生化，操作繁瑣，分析時(shí)間長(zhǎng)。本研究擬采用同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（isotope dilution liquid chromatographytandem mass spectrometry，ID-LC-MS/MS），以液液萃?。╨iquid-liquid extraction，LLE）方式進(jìn)行樣本前處理，建立測(cè)定血清醛固酮的候選參考方法。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

AB SCIEX QTRAP 5500液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（美國(guó)SCIEX公司）、Thermo Hypersil BDS C18柱（100 mm×2.1 mm，粒徑2.4 μm，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）、XS 205DU型分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）、Eppendorf移液器（德國(guó)Eppendorf AG公司）、Milli-Q超純水系統(tǒng)（德國(guó)Millipore公司）。

醛固酮標(biāo)準(zhǔn)品[純度≥99%，濃度為（106.4±0.1）μg/mL]和內(nèi)標(biāo)醛固酮-2H7[純度≥98.85%，濃度為（102.9±0.1）μg/mL，同位素豐度為98%]均購(gòu)自美國(guó)Iso Sciences公司。無(wú)水乙醇、甲基叔丁基醚、甲醇均為色譜級(jí)，購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品制備 采用重量法配制醛固酮和醛固酮-2H7標(biāo)準(zhǔn)溶液，用乙醇稀釋，分別制備成674.77 ng/g醛固酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和653.63 ng/g醛固酮-2H7儲(chǔ)備液。進(jìn)一步用乙醇稀釋醛固酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分別制備出濃度為1.345 26 ng/g的醛固酮標(biāo)準(zhǔn)工作液1，濃度為0.363 85 ng/g的醛固酮標(biāo)準(zhǔn)工作液2以及濃度為0.758 16 ng/g的醛固酮-2H7工作液。配制的溶液-20 ℃密封避光保存。

1.2.2 樣本前處理 移取0.25 mL內(nèi)標(biāo)工作液至5 mL離心管并用天平稱重，加入血清之前將溶劑吹干以避免蛋白沉淀。準(zhǔn)確稱取0.5 mL血清樣本，加入已吹干的5 mL離心管中。樣本和內(nèi)標(biāo)在室溫條件下溫和振蕩平衡10 min。然后加入2.5 mL甲基叔丁基醚，振蕩10 min，2 560×g離心3 min后吸取上清液至新的5 mL離心管中。將萃取物在35 ℃條件下用氮?dú)獯蹈?，再加?00 μL 30%（V∶V）甲醇水溶液復(fù)溶，混勻，13 000×g離心5 min，取150 μL上清，加入進(jìn)樣瓶中，用于LC-MS/MS分析。

1.2.3 液相色譜條件 色譜柱為Thermo Hypersil BDS C18柱，流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為純水，流速為0.3 mL/min，柱溫為40℃，進(jìn)樣體積為10μL。梯度洗脫（0→4 min，30%A→60%A；4→4.1 min，60%A→95%A；4.1→5 min，95%A；5→5.1min，95%A→30%A；5.1→7 min，30%A）。

1.2.4 質(zhì)譜分析條件 采用電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）負(fù)離子模式，離子化電壓-4 500 V，霧化溫度550 ℃，霧化氣、輔助加熱氣和氣簾氣分別為40、55、15 psi。采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式掃描分析。見表1。

1.3 方法性能評(píng)估

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性評(píng)價(jià) 采用重量法通過(guò)向內(nèi)標(biāo)工作液添加不同質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)工作液制作9點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線，使得標(biāo)準(zhǔn)與內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量比值范圍為0.1～4.5，醛固酮的濃度范圍為0.08～3.55 nmol/L。將標(biāo)準(zhǔn)和內(nèi)標(biāo)混合溶液在35 ℃條件下用氮?dú)獯蹈?，再加?00 μL 30%（V∶V）甲醇水溶液復(fù)溶，混勻，轉(zhuǎn)移到進(jìn)樣瓶中用于LC/MS/MS分析。每個(gè)濃度樣本測(cè)定2次，取均值。各濃度的檢測(cè)偏移＜15%，且r＞0.99可判斷為呈線性[9]。

1.3.2 干擾評(píng)價(jià) 將16種與醛固酮結(jié)構(gòu)類似的類固醇激素作為潛在干擾物進(jìn)行評(píng)價(jià)。用50%（V∶V）甲醇水溶液配制高于正常生理濃度的類固醇激素溶液（濃度為500 nmol/L的皮質(zhì)酮、皮質(zhì)醇、睪酮、硫酸脫氫表雄酮、脫氫表雄酮、雌二醇、孕酮、可的松、17-羥孕酮、17-羥孕烯醇酮、11-脫氧皮質(zhì)醇、21-脫氧皮質(zhì)醇、11-脫氧皮質(zhì)酮、雌酮、雙氫睪酮和雄烯二酮），并采用ID-LC-MS/MS檢測(cè)。若醛固酮保留時(shí)間（4.19 min）無(wú)色譜峰，則這些結(jié)構(gòu)類似物對(duì)血清醛固酮定量不存在干擾。另外，為了評(píng)估其他潛在干擾，通過(guò)比較標(biāo)準(zhǔn)溶液和90份血清樣本中醛固酮定性離子/定量離子（confirmation ion to quantitation ion，CI/QI）比值的平均值，若差異＜20%可判斷為不存在影響血清醛固酮定量檢測(cè)的潛在干擾[10]。

1.3.3 檢測(cè)限與定量限（limit of quantitation，LOQ） 用已知濃度的血清樣本（0.225 nmol/L）稀釋得到3個(gè)濃度梯度的樣本（編號(hào)為1、2、3），即預(yù)期LOQ限樣本，分別計(jì)算每個(gè)濃度樣本的濃度測(cè)定均值與理論濃度的偏差及精密度。LOQ要滿足偏移＜20%、變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）＜20%、信噪比（signal-to-noise ratio，RSN）≥10，以RSN=3時(shí)的計(jì)算濃度值為檢測(cè)限[9]。

1.3.4 精密度評(píng)價(jià) 測(cè)定3個(gè)批次低濃度（0.208 nmol/L）、中濃度（1.295 nmol/L）、高濃度（2.880 nmol/L）血清醛固酮，每個(gè)濃度樣本重復(fù)測(cè)定5次，分別計(jì)算批內(nèi)CV和批間CV。

1.3.5 準(zhǔn)確度評(píng)價(jià) 通過(guò)加標(biāo)回收和室間比對(duì)研究2種方式對(duì)方法的準(zhǔn)確度進(jìn)行評(píng)價(jià)。（1）加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)：分別稱量濃度為6.747 7 ng/g的醛固酮標(biāo)準(zhǔn)溶液0.05、0.25、0.5 mL，氮?dú)獯蹈珊蠓謩e加入已知濃度（0.362 nmol/L）的混合血清（B），采用重量法各加入3.5 mL，混勻，制備出3個(gè)濃度的加標(biāo)樣本，分別計(jì)算添加理論濃度（C），然后將各個(gè)濃度的加標(biāo)樣本（各6份）進(jìn)行處理后進(jìn)樣檢測(cè)，得到實(shí)際測(cè)定濃度（A），加標(biāo)回收率（R）=（A-B）/C×100%?；厥章蕬?yīng)滿足100%±10%。（2）室間比對(duì)研究：采用建立的ID-LC-MS/MS測(cè)定國(guó)際臨床化學(xué)和檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)聯(lián)合會(huì)參考實(shí)驗(yàn)室外部質(zhì)量評(píng)價(jià)計(jì)劃（the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine External Quality Assessment Scheme for Reference Laboratories in Laboratory Medicine，RELA）樣本，對(duì)每個(gè)批次3份樣本進(jìn)行前處理，連續(xù)測(cè)定2個(gè)批次，將測(cè)量結(jié)果與RELA回報(bào)結(jié)果作偏移比較，偏移在±8.75%判斷為可接受。

1.3.6 基質(zhì)效應(yīng) 采用基質(zhì)混合實(shí)驗(yàn)的方法來(lái)評(píng)價(jià)相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)，通過(guò)檢測(cè)血清基質(zhì)樣本（A）、溶液基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液（B）、血清和溶液50∶50（質(zhì)量比）混合物（C）、血清和溶液80∶20（質(zhì)量比）混合物（D）、血清和溶液20∶80（質(zhì)量比）混合物（E）這5種基質(zhì)樣本中標(biāo)準(zhǔn)與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值來(lái)計(jì)算相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)。1∶1混合物相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)=[C-（A+B）/2]/[（A+B）/2]×100%；80∶20混合物的相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)=[D-（0.8A+0.2B）]/（0.8A+0.2B）×100%；20∶80混合物的相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)=[E-（0.2A+0.8B）]/（0.2A+0.8B）×100%。如果3種混合物計(jì)算得到的結(jié)果＜20%，則視為無(wú)相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)[11-12]。

1.4 不確定度評(píng)估

依據(jù)《測(cè)量不確定度表示指南》（Guide to the Uncertainty in Measurement，簡(jiǎn)稱GUM），測(cè)量結(jié)果的濃度計(jì)算公式為C=（A/A內(nèi)標(biāo)-b）/k×fc×fm，式中C為醛固酮的測(cè)定值（ng/mL）、A/A內(nèi)標(biāo)為樣本與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值、b為標(biāo)準(zhǔn)曲線截距、k為標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率、fc為標(biāo)準(zhǔn)與內(nèi)標(biāo)溶液濃度修正因子、fm為樣本處理修正因子。從標(biāo)準(zhǔn)工作液配制、樣本處理、儀器檢測(cè)及重復(fù)測(cè)量4個(gè)方面分析不確定度來(lái)源，并量化各個(gè)分量[9]。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性評(píng)價(jià)

純?nèi)芤汉脱鍢颖局腥┕掏獦?biāo)準(zhǔn)和內(nèi)標(biāo)的色譜圖見圖1。標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，醛固酮在0.08～3.55 nmol/L范圍內(nèi)呈線性。

圖1 醛固酮和醛固酮-2H7的色譜圖

圖2 ID-LC-MS/MS檢測(cè)血清醛固酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 干擾評(píng)價(jià)

在醛固酮的檢測(cè)條件下，16種類固醇激素在醛固酮保留時(shí)間（4.19 min）無(wú)干擾峰，在4.54 min出峰也能與醛固酮的峰基線分離，表明16種類固醇激素對(duì)血清醛固酮定量檢測(cè)不存在干擾，見圖3。標(biāo)準(zhǔn)溶液和血清樣本中醛固酮CI/QI比值的平均值分別為0.71和0.69，偏移為2.3%，表明該方法不存在影響血清醛固酮定量的潛在干擾。見表2。

圖3 類固醇激素和醛固酮標(biāo)準(zhǔn)的色譜圖

表2 標(biāo)準(zhǔn)溶液和血清樣本中CI/QI比值

2.3 LOQ和檢出限

血清醛固酮的LOQ為0.045 nmol/L，檢測(cè)限為0.012 nmol/L。見表3。

2.4 精密度評(píng)價(jià)

血清醛固酮低、中、高濃度的批內(nèi)、批間CV分別為＜5.0%和＜4.1%，見表4。

表3 醛固酮的LOQ評(píng)估結(jié)果

表4 醛固酮的精密度評(píng)價(jià)結(jié)果

2.5 準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)

2.5.1 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn) 血清醛固酮加標(biāo)樣本平均回收率為98.52%～100.14%，準(zhǔn)確度滿足要求，見表5。

2.5.2 室間比對(duì)研究 RELA-A和RELA-B樣本醛固酮濃度測(cè)定結(jié)果的偏移分別為-0.22%和-1.53%，符合判斷標(biāo)準(zhǔn)。見表6。

2.6 基質(zhì)效應(yīng)

3種混合物計(jì)算得到的相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)分別為3.01%、3.52%和3.65%，均＜20%，表明基質(zhì)效應(yīng)是否存在并不影響目標(biāo)分析物的準(zhǔn)確定量。見表7。

表5 醛固酮加標(biāo)回收率結(jié)果

表6 2018年RELA樣本各實(shí)驗(yàn)室測(cè)定結(jié)果

表7 相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)評(píng)估結(jié)果

2.7 不確定度評(píng)定

對(duì)3種不同濃度血清樣本進(jìn)行不確定度評(píng)定。3份血清樣本的相對(duì)擴(kuò)展不確定度分別為4.44%、5.36%和4.62%，見表8。3號(hào)血清樣本的不確定度來(lái)源及數(shù)據(jù)分析結(jié)果見表9，其他2個(gè)編號(hào)血清樣本的不確定度來(lái)源與之相同。

表8 3份不同濃度樣本不確定度的評(píng)估結(jié)果

表9 3號(hào)血清樣本的不確定度來(lái)源及數(shù)據(jù)分析表

3 討論

GC-MS是目前測(cè)定類固醇激素公認(rèn)的參考方法，但測(cè)定前必須先對(duì)樣本進(jìn)行衍生化，然后才能進(jìn)行檢測(cè)。與GC-MS相比，LCMS/MS具有許多優(yōu)勢(shì)，無(wú)需衍生化，樣本制備更加簡(jiǎn)單。目前已有測(cè)定醛固酮的LC-MS/MS候選參考方法[1]，采用Sciex API Ⅲ質(zhì)譜結(jié)合大氣壓化學(xué)電離源（atmospheric pressure chemical ionization，APCI）電離得到的LOQ為0.042 nmol/L。但該參考方法使用的內(nèi)標(biāo)（氟美松）的保留時(shí)間與醛固酮的保留時(shí)間不同，因此基質(zhì)成分可能會(huì)影響醛固酮和內(nèi)標(biāo)的反應(yīng)。VAN DER GUGTEN等[3]采用API 5000質(zhì)譜結(jié)合ESI電離負(fù)離子模式測(cè)定醛固酮的LOQ為0.05 nmol/L[3]。本研究的LOQ為0.045 nmol/L，與文獻(xiàn)報(bào)道[3-4]基本一致。

離子抑制或增強(qiáng)是質(zhì)譜方法分析生物樣本中存在的一個(gè)主要問(wèn)題。因此，本研究對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行了評(píng)估，結(jié)果顯示相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)為2.56%～3.62%。另外，血清樣本中醛固酮和內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間為4.16～4.20 min，可與內(nèi)源干擾物基線分離，能夠幫助減小離子干擾。

本研究建立的ID-LC-MS/MS方法采用LLE將醛固酮從樣本中萃取出來(lái)，經(jīng)過(guò)純化、濃縮后進(jìn)入液相，反相色譜能有效保留醛固酮，將其與其他內(nèi)源物質(zhì)分離后，依次進(jìn)入質(zhì)譜儀，以減小對(duì)醛固酮的基質(zhì)干擾。質(zhì)譜分析采用電噴霧電離負(fù)離子模式及多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式同時(shí)檢測(cè)母離子和子離子，通過(guò)2級(jí)離子掃描，排除大量干擾離子，使得質(zhì)譜的化學(xué)背景降低，目標(biāo)物的RSN顯著提高，從而實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的高靈敏度和高特異性。目前使用的醛固酮萃取劑包括甲基叔丁基醚、二氯甲烷和二乙醚。本研究在預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)比較了幾種常見的有機(jī)萃取溶劑，包括二氯甲烷、二乙醚、甲基叔丁基醚、正己烷和乙酸乙酯。從提取回收率結(jié)果看，二氯甲烷和甲基叔丁基醚效果最佳。二氯甲烷位于體系的下層，不易轉(zhuǎn)移，甲基叔丁基醚位于體系的上層，更易操作。

本研究結(jié)果顯示，采用建立的ID-LC-MS/MS方法測(cè)定血清醛固酮濃度，線性范圍為0.08～3.55 nmol/L，檢測(cè)限為0.012 nmol/L，LOQ為0.045 nmol/L，批內(nèi)和批間CV分別為＜5%和＜4.1%，平均加標(biāo)回收率為9 8.5 2%～100.14%，測(cè)定RELA樣本的結(jié)果偏移＜1.6%。該法的靈敏度、精密度、準(zhǔn)確度、特異性和抗干擾性能均符合參考測(cè)量程序的要求。

綜上所述，本研究建立的基于ID-LC-MS/MS的血清醛固酮測(cè)定方法具有操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確性好、靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，有望成為測(cè)定血清醛固酮的參考方法。